原位电离质谱技术的应用与研究进展

劳哲

(梧州市疾病预防控制中心 理化检验科，广西 梧州 543002)

传统的质谱检测方法具有灵敏、稳定和准确等优点，但传统的电离技术需要在真空状态下封闭的离子源中进行，样品前处理需要较长的时间和消耗较多资源，同时仪器设备比较大型，便携性差，难以满足现场快速检测的需求。2004年Cooks研究小组在美国普渡大学首先研究了解吸电喷雾电离质谱技术的实际应用，开始了对原位电离质谱(Ambient Ionization Mass Spectrometr y ，AIMS)技术的探讨。至今AIMS在生物医学、环境监测、食品安全监测、农业、生物材料、法医刑侦鉴定等领域得到了广泛的应用。AIMS最突出的优点是对复杂样品在质谱的真空装置之外进行直接电离，可以减少甚至取消提取和浓缩步骤，简化分析流程，同时避免因复杂前处理过程造成样品中待测物损失，大量节省时间并减少物资消耗。AIMS与便携式可移动质谱检测器结合，非常适合现场分析，但AIMS也存在准确度和精密度比传统质谱技术相对较低的缺点。目前AIMS最常应用的电离技术主要为：解吸电喷雾电离(Desorption Electrospray Ionization，DESI)、纸 喷雾电离(Paper Spray Ionization，PSI)、探针电喷雾电离(Probe Electrospray Ionization，PESI)、液体萃取表面分析(Liquid Extraction Surface Analysis， LESA)、实时直接电离技术(Direct Analysis in Real Time，DART)、介质阻挡放电电离(Dielectric Barrier Discha rge Ionization，DBDI)、激光烧蚀电喷雾电离(Laser A blation Electrospray Iionization， LAESI)、快速蒸发电离(Rapid Evaporative Ionization，REI)和二次电喷雾电离(Secondary Electrospray Ionization，SESI)。本文将分别对以上的技术类型从电离源的工作原理、影响因素及应用实例进行总结，并对各自技术在实际应用时的优缺点和未来技术发展的方向进行讨论。

1 解吸电喷雾电离(DESl)

DESI是先把喷雾溶剂加上较高的电压，通过雾化装置的内部毛细管进行溶剂喷射，内部毛细管的外圈同时喷出高纯氮气瞬间雾化溶剂，使带电液滴冲击样品表面，样品被高速液滴冲击之后发生溅射，在氮气的作用下带电液滴继续去溶剂化，通过传输管进入质谱入口，然后用质谱检测器进行检测。DESI质谱成像的效果与质量与所用溶剂关系极大，改变溶剂系统可以检测样品表面的不同待测物。DESI喷嘴与样品溅射面、质谱入口之间的角度和距离对质谱成像谱图的信号强度和分辨率有很大的影响。DESI电离源的工作原理如图1。

图1 典型 DESl实验的示意图

在生物医学应用方面Song等开发了一种DESIMSI氢氘交换(HDX)方法，用于研究酸性肿瘤微环境，以测量肿瘤区域的pH值，这是一个对癌症生长的进展和恶性程度具有关键影响的因素。利用该技术，可通过将DO加入DESI喷涂溶剂中观察代谢物的HDX。携带羟基的物种对HDX过程的反应特别好，可以根据HDX的程度作为pH指标。不同的pH值会影响不同细胞的代谢，此方法可以为癌症进展和侵袭提供有价值的建议。Zhang等探索了DESI-MS技术对大脑代谢信号成像的应用，在阿尔茨海默病小鼠模型的脑组织中，检测脂肪酸、胆碱、甘油酯和磷脂酰乙醇胺等化合物的变化水平，以更好地了解脂质代谢功能障碍与阿尔茨海默病的相关性。Pruski等使用DESI-MS分析孕妇阴道拭子，研究阴道微生物组对早产风险的影响。该研究发现，特定的代谢物特征物质可以预测阴道微生物群的组成，以及与早产风险相关的炎症状态。这表明可以使用对阴道拭子检测的方法，按检测结果选择适当的预防性治疗防止孕妇早产的发生。Yamamoto等还尝试了DESI-MS技术在大鼠模型药物监测中的应用。研究者使用该技术对吸入给药后的大鼠肺中皮质激素环索奈德的空间分布进行成像。影像学显示环索奈德及其代谢物在整个气道和肺部存在差异分布。研究表明，药物主要分布在气道上皮，而代谢物分布在整个肺组织中。使用DESI对吸入药物分布进行质谱成像分析，为研究和提高微粒药物输送效率提供了一个有价值的方法。柯晴瑾等使用DESI-MSI技术和斑马鱼模式动物研究分析异甜菊醇类化合物的血脑屏障通透性，并分析其对神经细胞的抗缺氧保护作用。质谱成像结果显示STVNa及K-9的离子信号在斑马鱼体内分布不同，前者整体分布较为均匀，后者更集中于眼部、脑部、腹鳍、尾鳍等特定器官或部位。细胞活性结果显示K-9具备不逊于STVNa的抗缺氧再灌注的神经细胞保护活性，可为中枢神经药物研发初筛提供方法参考。在刑侦鉴定方面Lee等将nanoDESI应用于笔迹样本中墨水的深度依赖性分析，证明了根据化学成分的变化区分各个笔画的能力。该应用有助于区分不同时间产生的手写体和使用不同墨水的手写体，从而识别书面文件的非法更改。

2 纸喷雾电离(PSl)

纸喷雾电离(PSI)利用位于MS入口前面的三角形纸基板，在其上添加少量液体样品，然后添加喷雾溶剂。当对纸张施加高电压时，电离发生在基板的尖端，通过与传统ESI类似的机制产生离子。与其他基于电喷雾的AIMS技术相比，PSI的主要优点是使用了纸基质基板，它同时起到过滤器的作用，过滤掉可能导致基质效应的杂质。2015年，Kim等开发了一种称为锥形喷雾电离的PSI改进。该技术本质上是PSI的三维版本，由纸锥组成，而不是通常使用的平面三角形纸基板。纸喷雾通常需要在分析之前向纸基质中添加液体样品，而锥形喷雾可以分析未经处理的固体材料，只需将其添加到锥形内部即可。将喷雾溶剂添加到锥体尖端，并施加高压以诱导电喷雾。PSI电离源的工作原理如图2。

图2 纸喷雾电离源的模型

Li等研究开发了一种基于纸喷雾的呼出气分析方法。参与者被要求将呼出气样本放入Tedlar袋中，并使用里面装有试纸的气密注射器从袋中提取少量呼出气，使试纸能够捕获气相分析物。然后对纸张施加高电压，直接检索和分析纸张基板。这项技术是专门用来分析呼吸中的醛类物质的，醛类物质已被作为肺癌的潜在生物标志物。萃取的基础是通过席夫碱反应捕获气相醛，该反应是在样品采集之前将4-氨基硫酚施加于纸基质上引起的。这项新技术被应用于肺癌患者和健康志愿者的呼气，显示癌症患者呼气中的几种醛类物质显著增加，这与该领域的先前研究一致。 Liu等开发了毛细管PSI，这是对传统的纸喷雾方法的一种改进，可以提高对生物流体复杂基质的耐受性。该方法用于分析胎牛血清中的添加药物，以评估该技术在复杂生物学背景下检测临床相关药物的能力。这些结果还与标准PSI获得的结果进行了比较，表明喷雾稳定性得到了改善，信号强度也得到了改善。Cai等开发了一种纸喷雾法来监测工人的环境暴露危害因素，将纸条放置在参与者戴的口罩的内外表面。然后收集纸条并直接分析，以检测吸收到纸中的环境和呼出分析物。该研究表明，有可能使用AIMS开发一种可穿戴的采样设备，除了环境暴露外，还可以通过生物标记物检测来监测佩戴者的健康状况。

3 探针电喷雾电离(PESl)

PESI使用带电的金属细丝作为探针。移动探针在样品上接触式取样，回收探针至质谱的连接接口，施加电压产生的喷雾进入质谱内部。PESI的去除杂质干扰的能力更强。PESI电离源的工作原理如图3。

图3. 探针电喷雾电离源

Chen等开发了一种串式取样探针，该探针设计用于内窥镜中，以便在内窥镜操作过程中进行体内化学分析。该设备在操作过程中使探头与相关表面接触。使接触表面的分析物粘附在管柱上，并被输送到质谱离子入口管，分析物随后被电喷雾离子源电离。在这项研究中，这项新技术通过使用两米长的胃肠内窥镜对小鼠胃粘膜进行活体分析结果得到了其它实验数据的证实。

4 液体萃取表面分析(LESA)

LESA能够通过在样品表面和导电吸管尖端之间形成液体连接来提取分析物，在自动将移液管尖端重新定位在MS入口前方进行电喷雾之前，将溶剂反复吸入样品表面数秒钟。这项技术能够实现快速和自动化的表面采样，并已被证明在生物组织成像方面特别有前景。该技术最新的进展为microLESA技术，减少了传统LESA所针对的采样面积。探针电喷雾电离源的工作原理如图4。

图4 液体萃取表面分析工作原理

Ryan等把LESA技术进一步发展为microLESA，减少传统LESA所针对的采样面积。Zhang等研究了与LESA有点类似的MasSpec笔，它使用液-固萃取过程进行环境采样，溶剂通过一个易于使用的手持设备提取。该设备手动放置在与样品表面接触的位置，用于分析物提取，然后将含有萃取分析物的溶剂拉向质谱仪进行电离和分析。

5 实时直接电离技术(DART)

DART是利用电晕放电产生激发态氦气原子，加速后的氦气原子冲击并离子化待测物表层的物质，在几秒钟内就可以完成电离，然后导入质谱入口进行分析，方法的优点是待测样品可以是任何物理形态和任何形状，均可以快速进行检测。DART电离源的工作原理如图5。

图5 实时直接电离技术工作原理

连茹等运用DART-HRMS快速筛查样品中的γ-羟丁酸和氟乙酸盐，样品使用点取的方式进行进样，在全扫描模式负离子模式下12 Dip-it Samplers模式进样，以准分子离子峰进行检测。Ning等使用DART - MS方法在无需任何预处理的人尿液中直接测定肌酐，同时通过HPLC - UV进行分析对比验证，结果在允许偏差范围之内。蓝草等使用DART-HRMS方法测定化妆品中氯霉素，样品用乙醇提取后经超声萃取和稀释，然后采用12 Dip-it Samplers模式 在负离子模式下，以MRM模式进行检测。Chambers等采用DART-HRMS直接分析法，无需样品制备，检测胡椒衍生产品和植物材料中的卡瓦内酯，检测到6种主要卡瓦内酯和3种黄卡瓦胡椒素。建立了一种符合FDA验证指南的方法。

6 介质阻挡放电电离(DBDl)

DBDI把中空不锈钢针作为放电电极，中间通氦气；玻片下方使用金属作为基底电极，电极尖端和玻片表面的距离很小，当两个电极施加较高的电压时，不锈钢针和金属基底电极之间形成等离子体，安置在玻片上的待测物被电离后导入质谱仪进行测定。DBDI电离源的工作原理如图6。

图6 介质阻挡放电电离工作原理

Liu等开发了一种用于单细胞高通量分析的毛细管DBDI系统，用来分析胰腺癌细胞的脂类物质的特征质谱谱图。该装置把细胞悬浮液在到达DBDI离子源之前通过毛细管引入，电离发生在毛细管内，毛细管的输出口直接连接到MS入口。这项技术能够以每分钟38个细胞的速率对单个细胞进行高通量代谢分析，产生特征质谱谱图，从而得出待测癌细胞类型的分化。苏晶等使用DBDI串联质谱技术在大批的水产品中快速筛查孔雀石绿，待测的水产品简单清洗处理后，使用氦气流量为3 L/min、离子源温度为230℃的DBDI离子源条件下采用MRM模式进行分析，结果快速而准确。尚宇瀚等把微型电极管与玻片下的放电电极相靠近，玻片上的粉末状样品被瞬间离子化，快速完成芬太尼类化合物测定。

7 激光烧蚀电喷雾电离(LAESl)

LAESI的工作原理是脉冲激光束聚焦在分析物表面上，激光解吸与ESI离子源联用，从而在大气压力条件下进行电离。LAESI与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)组合时，激光烧蚀可以成功地用于待测品表面元素的定量分析。烧蚀的组分被等离子体源雾化并离子化成构成元素和同位素离子，随后通过质谱仪进行分析。LAESI电离源的工作原理如图7。

图7 激光烧蚀电喷雾电离技术工作原理

Taylor等利用‘LAESI显微镜’源在高空间分辨率下对细胞进行MS分析成像。这种光源配置使用了长距反射式物镜，既可以实现样品的可视化，又可以获得比常规LAESI装置更小的LAESI激光束剖面。他们分析了200个洋葱单细胞和精氨酸秋海棠的高空间分辨率成像，利用耦合傅里叶变换质谱仪进行了高分辨率和高精度的代谢组学研究。

8 快速蒸发电离(REl)

REI电离技术原理是首先使用带有高频电流的手持式智能刀(iKnife)切入样品表面，再通过样品表面瞬时产生信息丰富的蒸汽进入智能刀刀内部。借助样品传输管线和辅助装置到达质谱接口，然后蒸汽沿着传输毛细管到达加热的冲击器表面，使得蒸汽分子发生电离，产生的离子直接进入质谱真空，质谱前端的离子导向技术可有效去除潜在的污染物，保证质谱系统清洁度。REI电离源的工作原理如图8。

图8 快速蒸发电离技术工作原理

张蒙娜等利用基于智能手术刀(iKnife)结合REIMS的技术研究带鱼中磷脂和脂肪酸的含量在不同油温下会有不同的变化，在iKnife设置20 W功率时，待测物的离子响应值信号噪音比最高，同时使用用液相色谱-质谱联用法对新方法进行比对显示两种方法的误差在允许的范围内。

9 二次电喷雾电离(SESl)

SESI的工作原理为溶剂在初级电离源中雾化后与第二级电离源中的待测物进行第二次电离，电离完成后导入质谱进行分析。 SESI电离源的工作原理如图9。

图9 二次电喷雾电离技术工作原理

杜睿等在使用SESI串联超高分辨质谱技术，研究人呼出气中邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸酐、吲哚和丙酮，改变电离源内纯净零气、二氧化碳和氮气的混合比例，同时记录待测化合物的电离效果，结论为在把3种气体按一定的比例混合，可大幅增加灵敏度和减少基体干扰。

10 总结与展望

AIMS的发展改变了分析化学，使研究者能够以简单、快速、高效和便携的方式实现样品分析，它不仅适用于实验室，也适用于现场，它已经成为许多研究领域的重要工具。但是AIMS也有着基质效应干扰较大，准确度和精密度比传统质谱技术相对较低的缺点。此外AIMS各种方法的数据谱库需要更全面的数据分析积累，研究者们还需不断改进电离技术，使方法的定量能力、灵敏度等方面进一步提高，同时不断优化电离源的电离性能，保证检测结果的重复性和稳定性以扩大适用对象范围。

未来质谱仪的最大增量是原位电离小型质谱仪原位电离技术的不断发展促进了快速质谱分析的兴起，小型便携式AIMS是未来质谱检测技术发展最大优势，它的应用前景也将越来越广。将AIMS分析用于手术室诊断的研究，即在手术室中活体组织检查方式取样，再用质谱和原位采样技术判断肿瘤的类型以指导手术，在现场测定和大规模的筛查应用中AIMS比大型质谱具有不可替代的优越性。Davies等使用智能刀(iKnife)从有主动脉瘤的病人和健康人的胸部主动脉组织的样本中分别收集质谱，并用REI串联质谱进行分析，然后开发模型来区分这两种样本类型。该模型能够区分主动脉瘤和正常组织，准确度和精密度分别为88.7%和85.1%，避免了外科医生通常只根据主动脉的外观做出术中决定。郭项雨等使用PESI串联便携式质谱，把婴幼儿湿巾等样品的内含液均匀喷滴在纸基板上，进行电离分析，这个方法可以在保证准确度的同时在现场快速完成大批量的样品筛查，无需把样品送回实验室进行检测，大幅提高工作效率。

本文对解吸电喷雾电离、纸喷雾电离、探针电喷雾电离、液体萃取表面分析、实时直接电离技术、介质阻挡放电电离、激光烧蚀电喷雾电离、快速蒸发电离和二次电喷雾电离从电离源的工作原理、影响因素及应用实例进行总结，分析了各电离技术在实际应用时的优缺点。随着AIMS的快速样品筛查、待测物无损检测和快速疾病诊断和术中指导等技术优点不断得到改进和发展，它将在在临床医学、生物医学、环境、食品安全、生物材料、法医刑侦鉴定等更多研究领域得到大力发展，同时AIMS的小型化便捷化是未来发展的重点方向。