荧光定量PCR测定新型冠状病毒核酸Ct值测量不确定度的评定与应用探讨

雷务年 潘晓梅 利瑾玲

摘要：目的 探讨荧光定量聚合酶链式反应（PCR）测定新型冠状病毒核酸（2019-nCoV）Ct值的测量不确定度的评定在新型冠状病毒病肺炎防控工作中的应用价值。方法  一、采用定值质控品（稀释成750copies/ml使用）一次性做20个平行样和每天一次提取和扩增检测连续20天，并建立不确定度报告模型，分别得到的Ct值标准差作批内或批间评定A类不确定度;二、根据所使用检测器具提供的信息所获得的数据，评定B类不确定度;根据A类和B类不确定度结果确定合成不确定度和扩展不确定度;结果 750copies/ml质控品的扩展不确定度分别为 ORFlab基因为Ct（lab）=33.53±3.53  （k=2  p=95%）;N基因的扩展不确定度为 Ct（N）=35.80±3.80 （k=2  p=95%）;结论 荧光定量（PCR）测定（2019-nCoV）核酸Ct值引入扩展不确定度在一定范围内，有助于相关人员准确使用实验室给予的Ct值不确定度对疑似病人、无症状感染者作出准确判断以及病人出院后的监测管理，做出精准防控。

关键词：测量不确定度;荧光定量聚合酶链式反应（PCR）;（2019-nCoV）核酸;Ct值

【中图分类号】 Q345+.24 【文献标识码】 A      【文章编号】2107-2306（2022）12--01

荧光定量聚合酶链式反应（PCR）测定2019-nCoV核酸，是目前最常用的新型冠状病毒病肺炎检测方法[1-2]。作为判定检测结果的Ct值，其定义是荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》（试行第九版）[3]将Ct值≥35作新冠病人出院的标准。Ct值与其他量值测量一样，也会存在不确定度。ISO 15189《医学实验室质与能力的要求》[4]、中国合格评定国家认可委员（CNAS）最新发布的（CNAS-CL01-G003）《测量不确定度的要求》[5]除了对不确定度评定提出要求外，还强调实验室应该提供检测结果的不确定度，在适用时检测报告应报告检测结果的不确定度。荧光定量PCR法由于检测灵敏度高，同一或不同实验室的检测结果可比性还不能保证，建立量值溯源可使检测结果达到一致性[6]。在基因定量检测中，检测结果的不确定度评定已有诸多报导[7-8]。本文针对荧光定量PCR法检测2019-nCoV核酸时，对检出的Ct值给予测量不确定度评定。为保证实验室生物安全，使用阳性定值质控品替代阳性样品进行模拟检测，现报告如下：

1材料与方法

1.1材料  批内和批间重复性的实验，采用阳性质控品（广东和信，批号2021082），冻干粉，按照说明书保存于2-8℃冰箱中，稀释成750copies/ml后使用。

1.2试剂与仪器 提取试剂为西安天隆的试剂盒，扩增试剂为达安基因的荧光定量PCR 2019-nCoV 核酸检测试剂盒，GenRotex 96核酸提取仪和Gentier 96E荧光定量PCR分析仪为西安天隆的品牌。操作按试剂说明书进行。

1.3 测量不确定度的评定

3.讨论

荧光定量PCR法是目前检测新型冠状病毒感染的首选方法，该方法具大通量，检测快，准确度高等优点[9]。Ct值是判读“阴阳”性及出院标准的量值指标[3]。不同检测单位的检测结果往往会存在一定的偏差，如果仅以单一Ct值来判定，由于测量不确定度的存在，不同检测机构甚至是同一个检测机构使用不同检测试剂同时检测同一份标本，当Ct值处于阴阳性判定或出院标准Ct值的临界值时，就有可能呈现截然相反的两种检测结果，不利于檢测结果判断和解释。如果对检测的Ct值进行不确定度的评定，在结果报告中附上Ct值及其不确定度，使检测数据更可靠，也增加了检测结果之间的可比性。有助于检验人员、临床医师、防控人员等根据Ct值和受检者的临床症状及流调情况进行综合研判，做出精准防控，也很好的避免争议。

诚然，荧光定量PCR法检测2019-nCoV）核酸受到诸多因素的影响，检测前、中、后的因素均可导至假阳性[10]，采样管液量、采样部位、手法、检测后的人工基线和阈值调整等均可对检测结果产生影响。不同的检测试剂盒性能偏差[11]，所用的仪器品牌、型号等，也可能导致检测结果不同，只是目前还不能通过量化的不确定度数据进行评定。我们只有制定规范的SOP文件，严格要求检测人员遵守SOP文件规定，从采样开始到检测结果Ct值的基线或阈值的调整均按SOP文件规范执行，这样或能减少这些无法量化的不确定度。

对临床检验数据开展测量不确定度的评定，是临床实验室提高出具检验结果可靠性的重要保障，是临床检验工作科学性和准确性的体现，也是临床实验室专业技术水平高低的体现。

参考文献：

[1] 中华医学会检验医学分会. 2019新型冠状病毒核酸检测专家共识 [J] . 中华医学杂志，2020，100 （13）： 968-973.

[2] 中华人民共和国国家卫生健康委员会.新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第三版）[EB/OL].2020-01-28.

[3] 中华人民共和国国家卫生健康委员会.新型冠状病毒感染的肺炎治疗方案（试行第九版）[EB/OL].2022-03-24.

[4] International  Organization  for Standardization ISO 15189 .Medical laboratories particular requirements for qualify and competence [S].Geneva：Switzerland，ISO，2012.

[5] Clinical and Laboratory Standards Institute.CLSI C 51-A.Expression of measurement uncertainty in laboratory medicine [S]. Wayna： PA CLSI 51-A，2012.

[6] 李育敏，徐怡，阚丽娟等，.荧光定量PCR测定HBV DNA测量不确定度的评定与应用探讨[J].现代检验医学杂志，2019，34（03）：151-155.

[7] 熊娟，黄启红，伍玲燕，蔡大川，张志军，黄璇莹，陈敏儿.实时荧光定量PCR检测转基因玉米Bt176测量不确定度分析[J].安徽农业大学学报，2017，44（01）：119-123.DOI：10.13610/j. cnki. 1672-352x. 2017 0208.023.

[8] 刘伟平，杨新春，殷明刚.HBV-DNA实时荧光定量检测程序的测量不确定度评估及分析[J].国际检验医学杂志，2019，40（01）：59-61.

[9] 钟慧钰，赵珍珍，宋兴勃，等.新型冠状病毒核酸临床检测要点及经验[J].国际检验医学杂志，2020，41（05）：523-526.

[10] 侯盼飞，潘艳，祝丽晶，等.新冠病毒核酸检测中假阳性问题分析[J].中国国境卫生检疫杂志，2021，44（05）：373-374.DOI：10.16408/j.1004-9770.2021.05.022.

[11] 宋月娟，杨淑娟，马腾，等.新型冠状病毒4种荧光定量PCR检测试剂的检测性能分析 [J].西南国防医药，2020，30（12）：1073-1076.