彩叶树种蓝果树嫩芽组培快繁技术研究

王 松，杨 党，陈露茜，李钧敏

（1.台州林业技术推广总站，浙江 台州 318000；2.台州学院 浙江省植物进化生态学与保护重点实验室，浙江 台州 318000）

0 引言

蓝果树（Nyssa sinensisOliv.），浙江仙居当地又称“山甜李”，为蓝果树科，属落叶乔木，高可达20余m，分布于中国长江流域及以南各地，常生于海拔300～1700 m的山谷或溪边潮湿混交林中［1-2］。蓝果树树干通直，树冠呈宝塔形，树叶在春天萌发及深秋时均为红色，果实成熟后是深蓝色，是优良的乡土季节性彩叶树种［3］，具有较大的园林应用价值。但目前蓝果树现有资源以天然林为主，数量较少，且大多零星分布于深山或自然保护区中，而有关蓝果树人工繁殖和栽培的成功经验相对较少［3］；蓝果树人工栽培的繁殖方式主要是种子繁殖［4］，而蓝果树种壳坚硬，种子发芽率低（25%～40%）［5-6］，这大大限制了此树种的推广与应用。

组织培养是蓝果树实现快速繁殖和工厂化育苗的重要途径之一。近10年未见有关于蓝果树组织培养快速繁殖技术的系统研究报道，早期王春荣等［4］以茎段为外植体进行了相关研究，提出以9月中旬取半木质化茎段进行蓝果树组织培养较好，萌芽率和保存率较高，其余接种时期的嫩茎尖、嫩茎段及半木质化茎段材料污染率较高，萌芽率较低。本文以春冬季节蓝果树嫩芽为外植体，以期解决组培过程中取材受限及污染率等问题，并优化蓝果树的组织培养和快繁技术体系，为实现蓝果树工厂化育苗提供必要的技术支持。

1 材料与方法

蓝果树的组培及扩繁实验过程如图1所示。

1.1 材料

实验用蓝果树枝条取自仙居县广度乡西角村海拔800～900 m的针阔叶混交林内（地理坐标：28.95°N，120.76°E）。将剪刀用75%乙醇消毒后，剪取生长健壮无病害的一年生以上枝条，带回实验室备用。

1.2 方法

1.2.1 外植体的选择

2020年12月在仙居采样剪取蓝果树枝条，一部分以越冬芽作为外植体（I），一部分将枝条插在蒸馏水中待越冬芽萌发后作为外植体（Ⅱ）；2021年3月在仙居采样后将枝条浸泡在浓度为100 mg/L的ABT生根粉溶液中水培，7 d后，选取新长出的嫩枝芽作为外植体（Ⅲ），如图1（a）所示；2021年4月在仙居采集的蓝果树枝条上长的野外嫩芽直接作为外植体（Ⅳ）。

图1 蓝果树的组培及扩繁

1.2.2 培养基的制备

以MS加入7 g/L的琼脂和30 g/L的蔗糖为基本培养基，与不同种类及浓度的植物激素制备培养基；1/2WPM和1/2 MS生根培养基分别以1/2WPM、1/2MS加入7 g/L的琼脂和30 g/L的蔗糖为基础培养基；以上培养基调pH值至5.8～6.2。

1.2.3 外植体消毒及培养

用自来水冲洗尼龙网袋中的外植体2 h，然后在超净工作台中用75%乙醇消毒10 s，再用0.1% HgCl2处理5 min，用无菌水漂洗5次，每次3 min，置于无菌滤纸上，吸干表面水分。越冬芽剥去鳞片，萌发的越冬芽剥去鳞片及幼叶，露出叶原基，分别接到含MS无激素培养基的组培瓶中；实验室水培嫩枝芽及野外嫩芽均切除幼叶，芽分别接到含MS无激素培养基的组培瓶中。以上均置于（23±1）℃组培室中，每日光照14 h，光照强度2000 lux。每天记录污染率，连续记录5 d，污染率=（污染个数/消毒外植体总数）×100%；将无污染的芽转接到外植体启动培养基中，配方为：MS+0.3 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，30 d后统计不同外植体类型的成活率。死亡率=（死亡个数/消毒外植体总数）×100%；成活率=（成活个数/消毒外植体总数）×100%。

1.2.4 芽的继代增殖培养

将长势良好的芽转接到不同激素浓度的继代增殖培养基中：①MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA；②MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；③MS+0.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA；④MS+1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA；⑤MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；⑥MS+1 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA。接种后每隔30 d继代1次，更换培养基，培养50 d左右观察芽的生长情况。统计增殖系数，增殖系数=出芽数/原有芽数。

1.2.5 诱导生根

将继代不同次数的长度3～4 cm且长势较好的芽分别接到以下培养基中：①1/2WPM；②1/2WPM+0.1 mg/L NAA；③1/2WPM+0.5 mg/L NAA；④1/2WPM+1 mg/L NAA；⑤1/2WPM+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA，培养40 d左右统计生根数量、计算生根率；生根率=（生根个数/培养芽苗总数）×100%。

2 结果与分析

2.1 不同外植体对成活率的影响

选取不同外植体类型进行消毒处理后，接种于培养基上，结果如表1所示。从表中可以看出，以蓝果树越冬芽作为外殖体（I）和野外直接采的嫩芽外植体（Ⅳ）的污染率较高，分别为75%和60%，成活率分别为10%和20%；水培后萌发的越冬芽（Ⅱ）污染率较低，为20%，但成活率偏低，为55%；3月份水培长出的嫩枝芽（Ⅲ）污染率为0，成活率高达95%。结果表明：3月份水培长出的嫩枝芽为蓝果树嫩芽组培的最佳外植体。

表1 蓝果树不同类型外植体对成活率的影响

2.2 不同植物激素配比对芽增殖的影响

将长势良好的芽转接到不同激素浓度的继代增殖培养基中，发现细胞分裂素6-BA和生长素NAA浓度比例会影响芽的生长，结果如表2所示。比例过高或过低会导致增殖少，生长慢，叶片发黄，且会出现玻璃化现象。MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA为最佳继代增殖培养基，比例为10：1，增殖系数为6.2，芽生长状况较好，如图1（b）所示。

表2 不同激素配比对蓝果树芽增殖诱导的影响

2.3 不同植物激素配比对根系生长的影响

切取不同继代次数且生长状况良好的蓝果树不定芽接种至生根培养基培养，如图1（c）所示，结果发现继代次数为1～3次的不定芽生根率均为0，无法成功诱导生根；继代次数为4次的不定芽成功诱导生根，不同植物激素配比对根系诱导的结果如表3所示。从表中可以看出，生长素（NAA）在低浓度时可促进根的生长，高浓度时会抑制苗的生长，加入IBA提高了生根数和根的质量。在本研究配方中，1/2WPM+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA为最佳生根培养基，生根率可达100%，根健壮，长势较好，如图1（d）所示。

表3 不同植物激素配比对根系生长的影响

3 讨论与结论

为解决蓝果树外植体污染率高、取材时间受限等问题，本文在研究中选取春冬不同时期的嫩芽作为外植体，实验结果表明：3月份水培长出的嫩枝芽为蓝果树嫩芽组培的最佳外植体，污染率低且成活率高；越冬芽和4月份直接采集的嫩芽污染率较高，可能是因为野外环境中外植体表面及内部受到各类细菌和真菌的污染较多，加大了外植体灭菌的难度［7］。

在蓝果树继代繁殖过程中，王春荣等［8］发现细胞分裂素的类似物与生长素的类似物的配比以5～15为宜，增殖率较高，生长正常。本研究也发现细胞分裂素6-BA和生长素NAA浓度比例为10:1时，增殖系数较高，生长良好。同时发现，要经过继代培养4代以上，蓝果树才能成功诱导生根，表明继代次数对蓝果树生根影响较大。有研究认为：处于成年期的组培苗生根困难，而处于经过多代培养后从成年期状态回转到童年期状态的组培苗，生根相对要容易得多［9］。此外，在生根培养过程中发现，生长素在低浓度时可促进根的生长，在高浓度时却抑制了苗的生长，使用NAA与IBA的复合激素促进了蓝果树生根，这也和胡刚等［10］的研究结果一致。