诺丽果不同提取物抗氧化能力的比较研究

张清月， 董姝慧， 李胤豪， 赵艳丽， 史彬林， 闫素梅

(内蒙古农业大学动物科学学院；内蒙古自治区动物营养与饲料科学重点实验室，呼和浩特 010018)

随着我国饲料端全面禁抗的落实，研发可在饲料中添加、具有疾病预防功效的替抗产品便成为饲料行业备受关注的热点。诺丽(MorindacitrifoliaL.，Noni)，药名海巴戟，是一种在我国东南部地区广泛种植的小型灌木。诺丽果具有促进绒山羊体外瘤胃发酵的功效[1]，极具开发为绿色饲料添加剂及新型替抗产品的前景。国内外对于诺丽果的研究证实其各类提取物都具有良好的抗氧化活性，且主功效成分是诺丽果多糖、多酚和黄酮类物质。体外试验表明诺丽果多糖对DPPH和ABTS自由基的清除力均表现出浓度依赖效应，并以超声波辅助法提取的多糖表现最佳[2]。此外，成熟和未成熟诺丽果富多酚提取物均能以剂量依赖性的方式抵消活性氧诱导的人SW872脂肪肉瘤细胞内的氧化应激[3]。而诺丽果提取物制备的磷脂复合物外用凝胶(AMFE-p)对兔子口腔溃疡模型具有良好的疗效，10%AMFE-P的总酚和东莨菪素的累积释放率最高[4]。此外，经响应面法优化所得诺丽果黄酮，在浓度为8.00 mg/mL时，对DPPH自由基和羟自由基清除率最高[5]。有体外试验表明从诺丽果汁中分离出的芦丁和五羟黄酮具有良好的抗炎作用，可抑制LPS刺激的巨噬细胞中NO的产生，并可下调IKKα/β、I-κB α、NF-κB p65、一氧化氮合酶和环氧合酶2的蛋白表达[6]。目前国内外对于诺丽果的研究仍集中在其活性成分的提取及纯化工艺上，而对于诺丽原果提取物及其分离得到的单体化合物活性的比较研究还不够充分，尤其是对诺丽果中主功效成分抗氧化能力的强弱及其对诺丽果总抗氧化能力贡献率的研究仍缺乏相关资料报道，而这些方面的研究不仅能为诺丽果各成分与其抗氧化之前的关系提供参考价值，还对诺丽资源的综合利用及集约化养殖中替抗产品的开发具有重要意义。

本研究利用抗氧化活性综合(APC)指数结合总抗氧化能力(TAC)贡献率，基于当前较成熟的3种体外抗氧化能力评价方法——1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)法以及铁离子还原(FRAP)法[7]评价不同浓度梯度的诺丽果多糖、多酚和黄酮的抗氧化性能，以期为诺丽果资源在饲料领域的综合利用提供基础，也为饲料行业中替抗产品的开发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与主要仪器

诺丽果风干片，于65 ℃烘干，粉碎后过40目筛，得到诺丽果粉。DPPH、ABTS、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、抗坏血酸(VC)、没食子酸、芦丁、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、苯酚、蒽酮以及葡萄糖等均为国产分析纯。超声波清洗机(DTC-27J)、全自动酶标仪(SYNERGY H1)、紫外可见分光光度计(UV1780)等。

1.2 诺丽果多糖、多酚和黄酮的制备

诺丽果多糖采用超声波辅助浸提法提取[2]：将诺丽果粉20 g与蒸馏水以1∶33的比例混匀，于78 ℃超声浸提82 min(超声功率：605 W)。之后，6 000 r/min离心15 min得到诺丽果多糖溶液。将溶液于55 ℃旋转蒸发浓缩至100 mL。冷却至室温后，加入3倍体积无水乙醇，在4 ℃沉淀24 h。最后，6 000r/min离心15 min，将所获沉淀于-50 ℃冻干，粉碎后得到诺丽果多糖(NFS，得率为12.08%)。

诺丽果多酚采用超声波辅助浸提法[8]提取：将诺丽果粉20 g与53%的乙醇溶液以1∶32的比例混匀，于50 ℃超声浸提33 min(超声功率：605 W)。之后，6 000 r/min离心15 min得到诺丽果多酚溶液。将溶液于50 ℃旋转蒸发浓缩至100 mL。最后，-50 ℃冻干并粉碎得到诺丽果多酚(NFP，得率为35.52%)。

诺丽果黄酮采用超声波辅助浸提法提取[5]：将诺丽果粉20 g与90%的乙醇溶液以1∶35的比例混匀，70 ℃超声浸提15 min(超声功率：605 W)。之后，6 000 r/min离心15 min得诺丽果黄酮溶液。将溶液于60 ℃旋转蒸发浓缩至100 mL。最后，-50 ℃冻干并粉碎得到诺丽果黄酮(NFF，得率为27.08%)。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 NFS中的总糖、总酚和总黄酮含量

NFS中的多糖含量测定：即多糖含量=总糖含量-还原糖含量。总糖含量采用蒽酮硫酸法[9]测定，取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的250 mg/L葡萄糖标准溶液，补水至2 mL，加入6 mL用88%硫酸配制的4 g/L蒽酮硫酸溶液，漩涡混匀后沸水浴10 min，冷却至室温后测定620 nm处的吸光值，制作标准曲线并求回归方程。用2 mL蒸馏水配制250 mg/L NFS溶液代替葡萄糖标准溶液，其余操作同上，测定NFS中的总糖含量。

还原糖含量的测定采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法[10]并稍作修改。向500 mL 37%酒石酸钾钠热水溶液中依次加入6.3 g DNS、262 mL 8% NaOH溶液、5 g结晶酚和5 g无水Na2SO3，待溶解冷却后，蒸馏水定容至1 000 mL，避光放置7 d后即得DNS试剂。分别向刻度试管中加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的1.0 mg/mL葡萄糖标准溶液，补水至2 mL，加入1.5 mL DNS试剂，混匀后沸水浴准确加热5 min，冷却至室温后用蒸馏水定容至20 mL，混匀后测定540 nm处的吸光值，制作标准曲线并求回归方程。用2 mL蒸馏水配制的2mg/mL NFS溶液代替葡萄糖标准溶液，其余操作同上，测定NFS中还原糖的含量。

NFP中总酚含量采用福林酚法测定[11]。将53%乙醇溶液配制的0.5 mg/mL没食子酸标准溶液梯度稀释至浓度为100、20、10、5、2.5、1.25 μg/mL的没食子酸工作液。分别取不同浓度梯度的工作液0.5 mL，依次加入1 mL福林酚试剂和4 mL 7.56%碳酸钠溶液，旋涡混匀后室温静置2 h，于波长765 nm比色，绘制标准曲线并求回归方程。用0.5 mL 53%乙醇配制的500 μg/mL NFP溶液代替没食子酸工作液，其余操作同上，测定NFP中总酚的含量。

NFF中的总黄酮含量采用NaNO2-Al(NO3)3显色法测定[12]。精确移取体积为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL用90%乙醇配制的200 mg/L芦丁标准溶液，补加90%乙醇至5mL，混匀后加入0.5 mL 5% NaNO2，混匀后静置6 min，加入4 mL 4%NaOH，静置15 min后于波长510 nm处比色，绘制标准曲线并求回归方程。用1 mL 90%乙醇配置的200 mg/L NFF溶液代替芦丁标准溶液，其余操作同上，测定NFF中总黄酮的含量。

1.3.2 NFS、NFP和NFF的抗氧化活性

1.3.2.1 DPPH法参照Khan等[13]，并稍作修改进行测定。分别吸取2 mL不同浓度的诺丽果各提取物溶液(0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL)，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，混匀后室温避光反应30 min，之后于波长517 nm测定吸光值。以VC为阳性对照。建立不同浓度样品与对应DPPH自由基清除率的回归方程，计算对DPPH自由基清除率达50%时所需的样品浓度(mg/ mL)，用EC50表示。

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A0为提取物溶剂代替样品的反应体系吸光值;A1为提取物样品的反应体系吸光值;A2为提取物溶剂代替DPPH的反应体系吸光值。

1.3.2.2 ABTS法参照Aati等[14]方法并稍加修改进行测定。将7.0 mmol/L ABTS溶液与2.45mmol/L过硫酸钾溶液等体积混匀，室温避光反应16 h得到ABTS自由基贮备液。用各提取物的溶剂对贮备液进行稀释，使其在波长734 nm处的吸光值为(0.070±0.02)，于30 ℃避光平衡30 min后得ABTS自由基工作液(现用现配)。取1 mL不同浓度的各提取物溶液(梯度浓度同1.3.2.1)，加入1 mL ABTS自由基工作液，于30 ℃避光反应4 min，测定波长为734 nm的吸光值。以VC为阳性对照。建立不同浓度样品与相应ABTS自由基清除率的回归方程，计算对自由基清除率达50%时所需的样品浓度(mg/mL)，用EC50表示。

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A0为提取物溶剂代替样品的反应体系吸光值；A1为提取物的反应体系吸光值；A2为提取物溶剂替代ABTS工作液的反应体系吸光值。

1.3.2.3 FRAP法参照Benzie等[15]并稍作修改测定。将0.3 mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 3.6)、0.01 mol/L TPTZ溶液和0.02 mol/L FeCl3按照体积比为10∶1∶1混匀，制得FRAP工作液。取0.5 mL不同浓度的各提取物溶液(梯度浓度同1.3.2.1)，加入3 mL于37 ℃预热的FRAP工作液，混匀后于37 ℃反应15 min，测定波长593 nm处的吸光值。以VC为阳性对照。用不同浓度的FeSO4溶液代替样品，其余操作同上，建立浓度与吸光度的线性回归方程，用A1-A0-A2差值计算出相应的FeSO4浓度。根据不同浓度样品与对应的FeSO4浓度建立回归方程，计算与0.1 mmol/L FeSO4溶液具有相同抗氧化活性的样品浓度(mg/mL)，用EC0.1值表示。

1.3.3 诺丽果不同提取物总抗氧化活性评价

使用APC指数[16]结合不同提取物对诺丽果TAC的贡献率[17]评价诺丽果不同提取物的总抗氧化活性。

式中：EAPC(APC指数当量)为每种提取物的APC指数×每克诺丽果中每种提取物的含量(得率)；TAC为每克诺丽果中所有提取物的EAPC之和。

1.4 统计与分析

2 结果与分析

2.1 各提取物的多糖、总酚与总黄酮含量

总糖和还原糖的标准曲线分别为图1和图2所示。根据总糖标准曲线方程计算诺丽果多糖中的总糖含量为296.4 mg/g，还原糖含量为25.2 mg/g，则多糖含量为271.2 mg/g。根据没食子酸的标准曲线(图3)方程计算NFP中的总酚含量为423.0 mg/g。根据芦丁的标准曲线(图4)方程计算NFF中的总黄酮含量为23.14 mg/g。

图1 总糖含量标准曲线

图2 还原糖含量标准曲线

图3 总酚含量标准曲线

图4 总黄酮含量标准曲线

2.2 诺丽果各提取物的抗氧化能力

2.2.1 利用DPPH、ABTS和FRAP法评价诺丽果提取物自由基清除能力和铁离子还原力

本研究利用DPPH法、ABTS法和FRAP法检测了3种诺丽果提取物的抗氧化能力，结果如图5所示。3种提取物对DPPH自由基的清除活性随浓度的增加而增加，其中，NFP和NFS表现出较好的量效关系(图5a)。3种提取物对ABTS自由基的清除活性均表现出良好的量效关系(图5b)。与阳性对照VC相比，3种提取物的Fe3+还原力均随浓度的增加而缓慢上升(图5c)。其中，NFP的量效关系略优于NFS和NFF。

图5 3种诺丽果提取物及VC对DPPH和ABTS自由基的清除作用及铁离子还原力

2.2.2 诺丽果各提取物总抗氧化活性的综合评价

EC50值表示对自由基的清除率达50%时提取物的浓度，因而该值越小表明提取物的抗氧化活性越强。由表1 所列DPPH EC50可知，3种提取物及VC清除DPPH自由基能力的大小依次为：VC>NFS>NFP>NFF。但随着浓度的增加，NFP和NFF对ABTS的清除力于0.4mg/mL时先达到阳性对照VC的水平。并且由表1中ABTS EC50可知，对ABTS自由基的清除能力由大到小依次为：VC>NFP>NFF>NFS。EC0.1值表示与0.1 mmol/L FeSO4溶液的抗氧化能力相同时的提取物浓度，因而该值越小表明提取物的抗氧化活性越强。如表1EC0.1所示，3种提取物及VC的Fe3+还原力由大到小依次为：VC>NFP>NFS>NFF。

在EC50和EC0.1的基础上进一步计算APC指数，并与不同提取物对诺丽果TAC的贡献率相结合，综合评价3种诺丽果提取物的总抗氧化活性，结果如表1所示。以阳性对照VC的APC指数为100%，则3种提取物的APC指数由大到小依次为：NFP>NFF>NFS。并且，3种提取物对诺丽果TAC的贡献率也依次为：NFP(52.59%)>NFF(36.08%)>NFS(11.33%)。

表1 3种诺丽果提取物抗氧化活性的综合评价

3 讨论

动物机体中所产生的活性氧自由基若不能被及时清除，便会因积聚而诱发氧化应激，进而对机体产生危害。抗氧化剂可作用于氧自由基，将其从细胞中清除或使其失活。DPPH法、ABTS法和FRAP法是3种常用的测试物质抗氧化能力的方法[7]。DPPH与ABTS均是比较稳定的自由基，DPPH法和ABTS法的目的即是分别测定抗氧化物质对这两种自由基清除能力的强弱，清除能力越强，则该物质的抗氧化能力越强。而FRAP法则是测定抗氧化物质对Fe3+还原力的强弱，还原力越强，则抗氧化性能越高。并且，这3种方法的亲脂性和亲水性均较佳，对脂溶性和水溶性物质的抗氧化性能测定效果均较好。因此，本研究选用上述3种方法测定不同浓度的NFP、NFS以及NFF的抗氧化能力。结果表明NFP、NFS和NFF均具有一定的抗氧化能力，但不同方法测得的抗氧化活性较强的提取物并不一致。清除DPPH自由基能力较强的为NFS；清除ABTS自由基能力较强的为NFP和NFF，分别是NFS的3.4和3.3倍；而Fe3+还原力较强的是NFP。这可能是由于3种提取物化学成分的固有复杂性及不同测试方法所响应的反应物并不一致造成的[16]。因而仅用一种方法难以准确评价不同提取物的抗氧化能力，因此本试验采用APC指数法将3种测试结果降维表示。结果表明3种提取物的综合抗氧化能力虽较阳性对照VC仍存在一定差距，但NFP和NFF的抗氧化综合能力在三者中较强，分别是NFS的2.1倍和1.9倍。因而仅就提取物本身的抗氧化活性而言，NFP和NFF较优。类似的研究也发现，白花蛇舌草提取液中多酚和黄酮的含量与其清除DPPH自由基的EC50值呈极显著负相关，相关系数分别为-0.886和-0.852；而得率最高的多糖，其含量则与EC50无显著相关性[18]。研究桑黄子实体抗氧化活性成分的试验也表明，其抗氧化活性物质存在于醇提物中，并且多糖在抗氧化中所起作用小，多酚和黄酮类为其主要抗氧化活性物质，二者的含量与抗氧化活性呈线性正相关[19]。这或许说明，多酚类和黄酮类物质本身的抗氧化活性优于多糖，具体机理还有待进一步验证。

3种提取物对诺丽果TAC贡献率由大到小的顺序与APC指数一致，均为NFP>NFF>NFS，但由于多酚的得率较高，三者之间的差距加大，NFP的贡献率分别是NFF和NFS的1.5倍和4.6倍。因此，在这3种诺丽果提取物中，具有较强抗氧化活性且对诺丽果TAC贡献率较高的是NFP。近期国内外对于诺丽抗氧化及抗炎成分的研究多集中于诺丽发酵果汁、诺丽叶及诺丽果渣上，较少见对于诺丽原果中抗氧化成分的研究。有学者采用生物驱动测定技术及植物化学分析技术分离出了诺丽发酵果汁中的5种抗炎成分，分别为车叶草苷酸、芦丁、(2E,4E,7Z)-deca-2,4,7-trienoate-2-O-β-d-glucopyranosyl-β-d-glucopyranoside和五羟黄酮，其中以芦丁和五羟黄酮的得率较高，为3 mg/L[6]。这与本试验的研究结果不尽相同，可能是因为上述研究的试验材料为诺丽发酵果汁，而在发酵过程中，由于微生物的作用，诺丽果中原活性成分及含量会发生一定的变化，从而与原果不同。研究强化诺丽果发酵的试验表明，在诺丽果自然发酵基础上接种植物乳杆菌可显著提高其总酚、总黄酮及槲皮素的含量，并提高发酵果汁的抗氧化能力[20]。本实验中NFP发挥抗氧化活性的具体功效物质尚不清楚，但关于诺丽发酵果渣的研究表明，诺丽果渣中含有16种酚类化合物，并以Isorhamnetin-3-O-rutinoside的含量最高[21]。但诺丽果渣为诺丽原果发酵产汁后的剩余部分，其功效成分可能随果汁浸出，或与原果所含化合物存在差异，因此NFP中发挥抗氧化活性的物质还需进一步探究。

4 结论

3种提取物的综合抗氧化活性及其对诺丽果TAC贡献率由大到小的顺序均为NFP>NFF>NFS，以NFP的贡献率较高且综合抗氧化能力较强。