樱桃叶斑病菌生物学特性及室内药剂筛选

王 磊，支欢欢，马永强，姚 强，陈红雨，张 纲，郭青云

（1.青海大学农林科学院植物保护研究所/青海省农业有害生物综合治理重点实验室/农业农村部西宁作物有害生物科学观测试验站，青海 西宁 810016；2.青海省海东市乐都区农业技术推广中心，青海 海东 810600）

0 引言

【研究意义】樱桃（Cerasus pseudocerasus）是蔷薇科（Rosaceae）樱属（Cerasus）落叶果树，是我国北方果实成熟较早的树种，素有“春果第一枝”的美誉[1]。樱桃果实口感酸甜，富含多种维生素和矿物质成分，能提高人体免疫力、抗衰老能力，极具医疗保健价值，故又被称为“水果中的宝石”[2]。此外，樱桃的根、果、核、枝、叶等皆可入药，能对多种疾病起到预防和治疗的作用，对人类的身体健康大有增益[3]。樱桃果实经济价值高，市场前景广，因此在我国各省市的种植面积逐年递增，主要集中在陕西、辽宁、山东、四川、江苏、甘肃等地区[4]。近年来，随着青海省樱桃产业规模的逐步扩大，降雨量增多，在樱桃上发生的病害种类和危害程度呈明显上升趋势，常发病害有褐腐病、流胶病、炭疽病和褐斑病等[5-8]，成为阻碍樱桃产业发展的主要因素之一。本课题组在青海省海东市乐都区洪水镇进行樱桃病害调查时发现叶斑病，其病害症状主要表现为叶片上产生水渍状、近圆形的褐色斑点，斑点周围有紫红色晕圈，严重时病斑相互连接成不规则状，叶片失绿黄化，影响光合作用，导致叶片过早脱落，严重阻碍樱桃来年树势的生长。据调查，该病害最早发病时期为6 月上旬，发病初期形成水渍状斑点，由于7 月中旬至8 月下旬降雨增多，果园湿度增大，病害迅速爆发，部分植株的叶片发病严重，发病率高达100%。【前人研究进展】本课题组前期将樱桃叶斑病病原菌鉴定为链格孢（Alternaria alternata）、细极链格孢（A.tenuissima）和杨柳炭疽菌（Colletotrichum salicis）[9]。杨柳炭疽菌属于炭疽菌属真菌的一种，目前，国内外关于杨柳炭疽菌生物学特性以及高效防治药剂的筛选等相关研究鲜有报道，而对炭疽菌属真菌引起的病害防治主要依赖于化学药剂。如刘一贤等[10]研究10 种杀菌剂对辣木果腐病病原菌兰生炭疽菌（Colletotrichum chlorophyti）的防效，结果表明咪鲜胺和嘧菌酯的防效最好；李文等[11]对百日草炭疽病病原菌防治药剂筛选结果表明氟啶胺和咪鲜胺的抑菌活性最强；张琳等[12]研究表明多菌灵、抑霉唑和甲基硫菌灵对南瓜炭疽病菌（Colletotrichum brevisporum）具有良好的防治效果。【本研究的切入点】杨柳炭疽菌是引起樱桃叶斑病的新病原菌，主要危害树势生长，严重影响樱桃产量，该病原菌生物学特性及室内毒力测定有待深入研究。【拟解决的关键问题】本研究旨在明确杨柳炭疽菌的生物学特性，筛选出防治效果最佳的杀菌剂，以期为青海省樱桃叶斑病的防治奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

自然发病的樱桃叶斑病样本采自青海省海东市乐都区洪水镇樱桃园，供试菌株为经樱桃叶斑病样品分离纯化并经本实验室准确鉴定命名并保存的杨柳炭疽菌（C.salicis）。

1.2 供试培养基

参照邵慧慧等[13]、张秀伟等[14]和吴松等[15]选用PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）、MS 培养基、OA（燕麦片琼脂培养基）、SA（淀粉琼脂培养基）、CPA（葡萄糖蛋白胨琼脂培养基）、RB（孟加拉红培养基）、MA（麦芽糖琼脂培养基）、YEA（酵母浸膏琼脂培养基）以及Czapek（査氏培养基）共9 种供试培养基对杨柳炭疽菌（C.salicis）进行培养，以筛选最适该病原菌的培养基。

1.3 供试药剂

本试验供试杀菌剂均为市售农药，具体信息见表1。

表1 参试药剂及其稀释倍数Table 1 Dilutions of tested fungicides

1.4 病原菌生物学特性研究

将分离的菌株C.salicis转接于PDA 上进行纯化，形成供试菌落备用。在不同培养条件下接种供试菌落培养7 d 后，采用十字交叉法测菌落直径[16]；培养10 d 后，从不同处理间培养皿的相同位置打取10 个直径为5 mm 的菌饼，将菌饼加入10 mL 无菌水中并充分混合制成孢子悬浮液，再用血球计数板测定产孢量[17]。

1.4.1 培养基对樱桃杨柳炭疽菌的菌落生长和产孢的影响 用灭菌的打孔器（5 mm）在供试菌落边缘打取菌饼，接至上述9 种供试培养基的平板中央，每个平板放一块菌饼，各处理重复3 次。

1.4.2 碳氮源对樱桃杨柳炭疽菌的菌落生长和产孢的影响 以PDA 为基础培养基，将供试菌落的菌饼分别接至以葡萄糖、山梨醇、乳糖、甘油、蔗糖、果糖、肌醇、麦芽糖和可溶性淀粉作为不同碳源培养基的平板上[18]，以硝酸钾、硝酸铵、牛肉膏、硫酸铵、酵母膏、蛋白胨、尿素和谷氨酸钠为不同氮源培养基的平板上[19]，不外加碳、氮源的PDA 作为对照，各处理重复3 次。

1.4.3 温度对樱桃杨柳炭疽菌的菌落生长和产孢的影响 将供试菌落的菌饼转接至PDA 平板中央，分别置于5、10、15、20、25、30、35 和40 ℃[20]处理下培养，各处理重复3 次。

1.4.4 pH 值对樱桃杨柳炭疽菌的菌落生长和产孢的影响 用0.1% NaOH 溶液（m/m）和0.1% HCl 溶液（V/V）将PDA 培养基的pH 值分别调节成4、5、6、7、8、9、10、11、12[21]，将菌饼移入不同pH 的PDA 培养基中央，重复3 次。

1.4.5 光照周期对樱桃杨柳炭疽菌的菌落生长和产孢的影响 无菌条件下，将供试菌落边缘的菌饼转接于PDA 平板中央，分别置于24 h 持续黑暗、12 h 光照和12 h 黑暗交替、24 h 持续光照条件下培养[22]，各处理重复3 次。

1.4.6 病原菌菌丝的致死温度 将菌饼（5 mm）挑入装有2 mL 无菌水的灭菌离心管中，置于35～70 ℃（梯度5 ℃）的恒温水浴锅中水浴10 min（先预热1 min）后取出冷却至室温[23]。将处理过的菌块置于PDA 培养基平板中央，重复3 次，以28 ℃为对照（CK），连续7 d 观察其生长状况，确定致死温度范围。在该范围内设置1 ℃温度梯度重复以上试验，确定致死温度。

1.5 病原菌室内药剂筛选

采用生长速率法，比较杨柳炭疽菌（C.salicis）对上述26 种杀菌剂的敏感性，参照李润根[24]、陈宏州[25]等的方法配制成含药培养基（表1）。在供试菌落边缘打取5 mm 菌饼，转接至PDA 平板中央，以不含药剂的PDA 为对照，重复5 次。在相同条件下培养7 d 后，测菌落直径，计算菌丝生长抑制率并将其换算成抑制几率值，运用最小二乘法直接建立“浓度对数-几率值”线性方程。采用Excel 2010 和SPSS 26.0 等软件计算各杀菌剂的抑制中浓度（EC50）。

2 结果与分析

2.1 病原菌的生物学特性

2.1.1 培养基对杨柳炭疽菌的菌落生长和产孢的影响在不同培养基上，C.salicis的生长和产孢差异显著（图1）。在SA 和PDA 上菌丝生长速度快，菌落直径显著高于其他处理；而在Czapek、OA、YEA 和CPA 上菌丝生长较快，菌落直径略低于SA 和PDA；在MA、MS 以及RB 上菌丝生长较慢，菌落直径显著低于其他处理，且RB 不利于菌落生长，菌落直径最小。病原菌产孢最多的培养基为PDA，产孢较少的培养基为OA、YEA、SA、CPA、MS 和RB 上，不产孢的培养基为MA 和Czapek。

图1 不同培养基对杨柳炭疽菌的菌落生长和产孢的影响Fig. 1 Effects of culture media on mycelial growth and sporulation of C.salicis

2.1.2 碳氮源对杨柳炭疽菌的菌落生长和产孢的影响C.salicis对供试碳源的利用存在较大的差异（图2）。以肌醇的培养基上菌丝生长最好，菌落直径显著大于对照；在含有山梨醇、葡萄糖、淀粉、麦芽糖和果糖的培养基上菌丝生长较快；而以乳糖、蔗糖、甘油为碳源的培养基上，菌落直径与对照差异不显著。该菌在不同碳源的培养基上均能产孢，且与对照相比差异显著。以葡萄糖和肌醇的培养基上产孢最多，在含有山梨醇、麦芽糖、乳糖和蔗糖的培养基上产孢次之，而以甘油和淀粉为碳源的产孢较少。

图2 不同碳源对杨柳炭疽菌的菌落生长和产孢的影响Fig. 2 Effects of carbon sources on mycelial growth and sporulation of C.salicis

C.Salicis对供试氮源的利用也存在较大差异（图3）。牛肉膏是适合菌丝生长的最佳氮源，其次为硝酸钾和谷氨酸钠，菌落直径均显著高于对照；在含有尿素、硝酸铵、蛋白胨和酵母膏的培养基上生长较慢，菌落直径与对照差异不显著；而以硫酸铵为氮源不利于菌丝生长。病原菌在含有蛋白胨的培养基上产孢最多，与硝酸铵、硝酸钾、牛肉膏和谷氨酸钠相比未达到显著水平，但均显著高于对照的产孢量；在以硫酸铵和尿素为氮源的培养基上的产孢量与对照差异不显著；而在含有酵母膏的培养基上，产孢受到抑制。

图3 不同碳源对杨柳炭疽菌的菌落生长和产孢的影响Fig. 3 Effects of nitrogen source on mycelial growth and sporulation of C.salicis

2.1.3 不同温度对杨柳炭疽菌的菌落生长和产孢的影响 如图4 所示，温度对C.salicis的菌落生长和产孢量均有显著影响，在20～35 ℃时菌丝生长良好，其中菌丝生长最快的是25 ℃，菌落直径最大，且显著高于其他处理；15 ℃和40 ℃时菌落生长较慢，而在5 ℃和10 ℃时菌落几乎不生长。病原菌在20～30 ℃下产孢较多，其中在25 ℃下产孢最多，且显著高于其他处理；在10、15、35 和40 ℃下产孢较少，其中40 ℃下产孢最少；而在5 ℃时不产孢。

图4 不同温度对杨柳炭疽菌的菌落生长和产孢的影响Fig. 4 Effects of temperature on mycelial growth and sporulation of C.salicis

2.1.4 不同pH 值对杨柳炭疽菌的菌落生长和产孢的影响 在不同pH 的培养基上，C.salicis的菌丝生长和产孢量如图5 所示。该菌株在pH 值为4～12 范围内均可以生长和产孢，pH 值为6～9 时菌株的生长状况和产孢较好，其中pH 值为7 时生长状况和产孢最佳；在pH 值为4～5 和10～12 时菌株的生长状况和产孢较差。

图5 不同pH 对杨柳炭疽菌的菌落生长和产孢的影响Fig. 5 Effects of pH on mycelial growth and sporulation of C.salicis

2.1.5 不同光照周期对杨柳炭疽菌的菌落生长和产孢的影响C.salicis在不同光周期培养下的菌落直径和产孢量具有较大差异（图6）。12 h/12 h（光/暗）交替培养有利于病原菌的生长和产孢，且显著高于其他两种光周期；在24 h 持续光照或黑暗条件下菌丝生长较慢，产孢量较少，且两者差异不明显。注：0 h，全黑暗；12 h，12 h 光照+12 h 黑暗；24 h，全光照 。

图6 不同光照周期对杨柳炭疽菌的菌落生长和产孢的影响Fig. 6 Effects of photoperiod on mycelial growth and sporulation of C.salicis

Note:0 h,24 h in the dark;12 h,12 h light+12 h dark;24 h,all day under light exposure

2.1.6 病原菌的菌丝致死温度测定C.salicis在35～55 ℃范围内水浴10 min，菌丝能够生长且产生菌落，但在60 ℃及以上条件下菌丝不生长，因此在55～60 ℃间将温度梯度缩小为1 ℃进行重复试验，结果在58 ℃水浴10 min 后菌丝不能正常生长，说明该菌的致死温度为58 ℃水浴10 min。

2.2 室内药剂筛选

室内毒力测定结果表明，26 种药剂对C.salicis的生长状况均具有一定的抑制作用，随着药剂浓度的增加抑制作用增强，且不同药剂之间的抑制效果差异较大（图7）。由表2 结果可知，在前20 种化学杀菌剂中，抑制效果最好的是10%苯醚甲环唑WG，EC50为0.60 mg·L-1；其次是325 g·L-1苯甲·嘧菌酯SC、430 g·L-1戊唑醇SC、60%唑醚·代森联WG和75%肟菌·戊唑醇WG，EC50分别为3.652、4.418、6.347 和8.69 mg·L-1；46%氢氧化铜WG、25 g·L-1咯菌腈FS、30%吡唑醚菌酯SC、250 g·L-1嘧菌酯SC、40%腈菌唑SC、50%啶酰菌胺WG 和75%百菌清WP，EC50分别是22.615、30.451、30.846、44.844、48.978、55.106 和73.097 mg·L-1，70%甲基硫菌灵WP、15%三唑酮WP、250 g·L-1丙环唑EC、80%多菌灵WP、80%丙森锌WP 和300 g·L-1苯甲·丙环唑EC，EC50分别为102.96、105.487、173.021、175.55、177.664和206.871 mg·L-1；抑菌效果较差的为80%代森锰锌WP 和500 g·L-1异菌脲SC，其EC50高 达679.36 和1 012.521 mg·L-1。在后6 种生物杀菌剂中，0.3%丁子香酚SL 的抑制效果最好，EC50为1.151 mg·L-1；其次是3%中生菌素WP 和8%宁南霉素WA，其EC50分别是16.236 和90.615 mg·L-1；再次是6%春雷霉素WA 和6%寡糖·链蛋白WP，EC50分别是157.389 和187.284 mg·L-1；而抑菌效果较差的为20%乙蒜素EC，其EC50高达301.439 mg·L-1。

表2 26 种杀菌剂对病原菌的毒力测定Table 2 Toxicity of 26 individual fungicides on C.salicis

图7 杀菌剂对杨柳炭疽菌的菌丝生长的抑制效果Fig. 7 Inhibitory effect of fungicides on C.salicis

3 讨论与结论

炭疽菌属真菌是重要的植物病原菌之一，能侵染多种植物不同部位，可引起世界范围内的多种病害[26-27]，如小长春花叶斑病[28]、拟南芥炭疽病[29]、草莓炭疽病[30]、柳树炭疽病[31]和三色堇叶斑病[32]等，严重影响全球农业生产规模的发展。叶斑病是青海樱桃生产中常见的高发性真菌病害之一，严重影响樱桃的产量和品质，造成较大经济损失。

本课题组通过对杨柳炭疽菌生物学特性的研究，发现不同培养条件均能影响杨柳炭疽菌的生长和产孢。试验表明，菌株在供试培养基上均能正常生长，在除MA 和Czapek 外的培养基上均可产孢，且在PDA 和SA 上的菌丝生长较快，在PDA 和OA上的产孢最多。在不同碳、氮源培养条件下，菌落生长和产孢的最适碳源分别为肌醇和葡萄糖；最适氮源分别为牛肉膏和蛋白胨。此病原菌对温度的适应范围较广，在5～40 ℃内均能生长，其中最适温度为25 ℃，但在温度为5 ℃时，菌落几乎不生长，这与孙洁等[33]和杨佳文等[34]的研究结果相似。病原菌对培养基酸碱度有较强的适应能力，在pH 为4～12 范围内均可以生长和产孢，最适pH 值为7，但过酸过碱均不利于菌丝生长和产孢，这与刘一贤等[10]对兰生炭疽菌菌丝生长的生物学特性研究结果一致。该菌在3 种光周期下均可正常生长与产孢，但最佳培养条件为光暗交替（12 h/12 h），说明该菌对光照的要求不高，这与秦健等[35]的研究结果相同。病原菌的致死温度为58 ℃，水浴处理10 min。

本研究通过对樱桃叶斑病杨柳炭疽菌的室内药剂筛选试验，发现26 种药剂对C.salicis的生长状况均具有一定的抑制作用，随着药剂浓度的增加抑制作用增强。试验表明，在供试杀菌剂中，10%苯醚甲环唑的抑制效果最好，EC50为0.6 mg·L-1，说明三唑类杀菌剂对C.salicis的抑制效果较强，这与冯思琪[36]对水稻胡麻叶斑病菌（Bipolaris oryzae）药剂筛选的研究结果相同；0.3%丁子香酚作为一种绿色环保型植物源杀菌剂对杨柳炭疽菌引起的樱桃叶斑病的防治效果明显，EC50为1.151 mg·L-1。此外，325 g·L-1苯甲·嘧菌酯、430 g·L-1戊唑醇、60 %唑醚·代森联和75 %肟菌·戊唑醇的原药对樱桃叶斑病菌毒力较强，EC50分别为3.652、4.418、6.347 和8.69 mg·L-1，均小于10 mg·L-1；这与姜苏月等[37]研究同属的羽扇豆炭疽菌（Colletotrichum lupini）对杀菌剂敏感性中唑醚代森联敏感性较高和邓洁等[38]研究同属的钩藤博宁炭疽菌（Colletotrichum boninense）对杀菌剂的毒力测定中肟菌·戊唑醇具有较强的防效的结果基本相同。但本试验使用的药剂中80%代森锰锌、20%乙蒜素和500 g·L-1异菌脲防治效果不佳，这与孟珂等[39]研究同属的薄壳山核桃炭疽菌（Colletotrichumspp.）对代森锰锌的敏感性较差的结果一致。

本研究对青海省樱桃叶斑病菌（C.salicis）的生物学特性进行分析并选用26 种杀菌剂对其进行室内毒力测定，该试验结果可为青海樱桃叶斑病的综合防治提供参考。但由于药剂试验是在室内进行，田间防治效果还需进一步验证。