牦牛妊娠期和产后乏情期卵巢蛋白组学分析

麻俊渊，王进娥，李 洋，胡凇茗，陈 舟，李书元，杨妍梅，扎西英派，霍生东

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

0 引言

【研究意义】牦牛是高原地区主要畜种，其繁殖性能较低，通常为两年一胎或三年两胎[1,2]。极少数牦牛在分娩后一定时间内机体恢复顺利进入下一个发情周期，而大多数会进入产后乏情期，呈不发情表现。造成哺乳动物产后乏情的外部原因有饲喂状况、温度气候、品种年龄和疾病等[3]。但造成牦牛产后乏情的关键生物因子及影响机制并不明确。本研究利用差异蛋白质组学分析，更好地分析理解牦牛妊娠分娩后易乏情的生理变化规律，对于深入研究妊娠期和产后乏情期卵巢的生理特性和揭示产后乏情机理具有一定参考价值。【前人研究进展】蛋白质组学（Proteomics）是探究生物体蛋白质组的组成及变化规律的科学[4]，该技术最初为阐明蛋白质的种类，现被广泛应用于精准确定特定蛋白质的结构和功能的研究[5]。蛋白质是生命活动的体现者和执行者，对蛋白质整体进行动态分析，能更深入揭示生命活动的真谛[6]。海超[7]对冷冻前后精子进行同步蛋白质组学分析探讨精子冷冻损伤的分子机制；赵国顺[8]建立了牦牛不同直径卵泡液蛋白表达图谱，发现了不同时期卵泡液对卵母细胞发育影响的关键蛋白及作用机制。阮崇美[9]通过构建不同发育期白牦牛睾丸蛋白质表达谱，发现白牦牛性机能旺盛期睾丸支持细胞增殖调控机制。Pei 等[10]通过分析不同直径牦牛卵泡差异表达蛋白，寻找到了卵泡成熟的标志蛋白。赵兴绪[11]利用蛋白质组学技术筛选出天祝白牦牛发情期与妊娠期卵巢差异表达蛋白。霍生东等[12]通过转录组与定量蛋白质组学分析相结合，筛选出卵巢周期停滞相关基因和蛋白质。【本研究切入点】牦牛在妊娠期和产后乏情期，卵巢上卵泡发育均处于静止状态[13]，但不同时期机体生殖生理活动却完全不同；且蛋白质组学技术在牦牛妊娠与分娩后卵巢周期停滞方面的应用尚未见有关研究。【拟解决的关键问题】通过蛋白质组学技术分析牦牛妊娠期和产后乏情期卵巢差异表达蛋白，整理发掘牦牛妊娠分娩后因卵巢停滞而导致乏情的关键生物因子，为开展牦牛乏情期与妊娠期相关蛋白研究与分子调控机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

在青海省海晏县牧民自然放牧牦牛群挑选6 岁左右、临床观察确定处于妊娠期和产后乏情期的母牦牛。

1.2 样品采集与处理

临床检查无可见疾病，挑选处于妊娠期和产后乏情期牦牛各3 头，屠宰后立即采集卵巢，修剪附属组织，预温生理盐水洗净卵巢表面的血迹污物，迅速放入液氮内保存运输。冻存样品送北京百迈客生物科技有限公司（Biomarker technologies）进行TMT（Tandem mass tags）定量蛋白质组学技术分析检测。

1.3 基于TMT 定量蛋白组学分析

1.3.1 卵巢蛋白质提取及含量测定 参照已有研究方法提取卵巢蛋白质[14]。适量的蛋白质裂解液（8 mol·L-1尿素、1%SDS），冰上超声2 min 后裂解30 min，4 ℃、12 000 r·min-1离心30 min，取蛋白质上清。使用Thermo Scientific Pierce BCA 试剂盒（Thermo，USA）进行蛋白定量。

1.3.2 酶解烷基化以及TMT 标记 取蛋白样品100 μg，用裂解液补充体积到100 μL。加入终浓度10 mmol·L-1TCEP 还原剂，在37 ℃下反应60 min。加入终浓度40 mmol·L-1碘乙酰胺，室温下避光反应40 min。每管加入预冷丙酮[V（丙酮）∶V（样品）=6∶1]，-20 ℃沉淀4 h，10 000 r·min-1离心20 min，弃上清。用50 mmol·L-1TEAB充分溶解样品，按照质量比1∶50（酶∶蛋白）加入Trypsin 在37 ℃ 酶解过夜。TMT 试剂（Thermo，USA）加入乙腈解冻重组，并加入多肽溶液进行标记，室温孵育2 h；加入羟胺，室温反应15 min，将等量标记产物混合于管中，真空浓缩仪抽干[14-15]。

1.3.3 LC-MS/MS 检测 采用纳升级液相色谱串联质谱技术（Easy-nLC 1200 结合Q Exactive 质谱仪）进行分析[15]。肽段用质谱上样缓冲液溶解，蛋白上样后经C18 色谱柱（75 μm×25 cm，Thermo，USA）分离120 min，体积流量为300 μL·min-1。EASY-nLC 液相梯度洗脱，流动A 相2%乙腈（加0.1%甲酸），B 相80%乙腈（加0.1%甲酸）。按照以下程序进行梯度洗脱：0～1 min、0～5% B 相，1～63 min、5%～23% B 相，63～88 min、23%～48% B 相，88～89 min、48%～100% B 相，89～95 min、100% B 相。MS 和MS/MS 采集之间自动切换，质谱分辨率分别是70 K和35 K。MS 扫描范围为（m/z）350～1 300，选择top20的母离子进行二级碎裂，动态排除时间为18 s。用软件Thermo Xcalibur 4.0（Thermo，USA）进行数据采集。

1.3.4 蛋白质比对及差异表达蛋白筛选 利用数据库检索得到原始数据后，按照Score Sequest HT＞0且unique peptide≥1，并去除空白值的标准筛选可信蛋白。计算组间蛋白质表达差异倍数（Fold change，FC），以1.5 倍差异表达，即|Log2FC|＞1.5 且P＜0.05作为差异表达蛋白（Differentially expressed proteins，DEPs）的筛选标准。

1.3.5 生物信息学分析 将鉴定到的蛋白质序列与GO、COG、KEGG 等数据库进行比对，获得蛋白在各数据库的注释信息。

1.4 数据统计分析

试验数据用SPSS 25 软件进行统计分析。生物量结果采用SPSS 25 软件对数据进行单因素方差分析（ANOVA），应用多重比较Tukey 检测对数据之间的差异性进行检验，P＜0.05、|Log2FC|＞1.5 时表示差异具有统计学意义。采用主成分分析（Principal component analysis，PCA）评价同时期卵巢蛋白质相似性。利用Origin 构建了不同时期卵巢组差异表达蛋白热图。

2 结果与分析

2.1 差异表达蛋白鉴定结果

试验共鉴定到4 457 个蛋白质，都具有定量表达信息。两组样本间有57 个差异表达蛋白，且与妊娠期组相比，产后乏情卵巢组织中表达上调蛋白38 个，表达下调蛋白19 个，差异表达蛋白信息见表1。

表1 差异表达蛋白信息统计Table 1 Statistical information on DEPs

续上表

2.2 总蛋白主成分分析

利用妊娠期组的3 个样本和产后乏情期组的3 个样本中定量蛋白强度数据进行主成分分析，如图1所示。结果表明，2 组样本分布在二维空间不同的区域，区分明显，显示妊娠期组和产后乏情期卵巢蛋白之间的分离趋势。

图1 总蛋白主成分分析Fig. 1 Principal component analysis on all proteins

2.3 差异表达蛋白热图分析

为了进一步显示妊娠期组和产后乏情期组之间的差异，将57 个差异表达蛋白利用层次聚类分析绘制了热图，如图2 所示。图中红色表示蛋白表达量高，绿色表示蛋白表达量低。系统聚类分析表明，2 组样本差异蛋白区分明显，表达模式存在差异，组内重复性良好，且聚类模式与主成分分析结果一致。

图2 差异表达蛋白热图Fig. 2 Heat map of DEPs

2.4 差异表达蛋白COG 分析

差异表达蛋白COG（Clusters of orthologous groups）分析结果（图3）显示，下调差异表达蛋白功能集中于核苷酸运输与代谢。上调差异表达蛋白功能集中于细胞周期、氨基酸转运与代谢、辅酶的运输和代谢、翻译与核糖体结构、无机离子转运与代谢和防卫机制等方面。差异表达蛋白在能源生产与转化、脂质运输与代谢、蛋白质周转、次生代谢物合成转运代谢等功能中均存在上调和下调差异表达蛋白，且以上调表达为主。

图3 差异表达蛋白COG 分析Fig. 3 COG analysis on DEPs

2.5 差异表达蛋白GO 分析

差异表达蛋白GO（Gene ontology）分析结果（图4）显示，各有221 个蛋白注释到生物学过程，主要集中在代谢、繁殖、生殖等生物过程；242 个蛋白注释到亚细胞组分，主要涉及细胞器成分、高分子复合物、膜部件等细胞组分；77 个蛋白注释到分子功能，主要参与转运活性等分子功能。

图4 差异表达蛋白GO 分析Fig. 4 GO analysis on DEPs

2.6 差异表达蛋白KEGG 分析

差异表达蛋白KEGG（Kyoto encyclo-pedia of genes and genomes）分析结果（图5）显示，妊娠组与产后乏情组卵巢组织57 个差异表达蛋白共参与到27 条KEGG 信号通路。其中与繁殖激素分泌调控有关的信号通路有卵巢类固醇生成和甾类激素生物合成；与能量代谢有关的信号通路有氨基酸的生物合成、碳代谢和谷胱甘肽的合成；与卵泡发育有关的信号通路有PI3K-Akt 信号通路。差异表达蛋白KEGG 分析结果提示牦牛产后乏情与生殖激素异常分泌调控、能量代谢失衡状态和卵泡不正常闭锁有着密切的关系。

图5 差异表达蛋白KEGG 分析Fig. 5 KEGG analysis on DEPs

3 讨论

3.1 牦牛生殖激素分泌的调节

产后乏情期胆固醇侧链裂解酶（Cytochrome P450 side chain cleavage enzyme，P450scc）、肾上腺素（Adrenaline）、线粒体（Mitochondrion）较妊娠期表达上调，通过KEGG 差异蛋白代谢通路分析发现P450scc 通过参与卵巢类固醇生成、甾类激素生物合成和细胞色素P450 生物代谢过程。胆固醇是体内合成的所有类固醇激素的初始底物[16]，牦牛性类固醇激素合成的第一步是肾上腺线粒体P450scc 催化胆固醇转化为孕烯醇酮[17,18]，生成的孕烯醇酮可作为底物，通过下游酶形成孕激素、雄激素和雌激素[19]。牦牛乏情期P450scc、Adrenaline 和mitochondrion 表达上调，加强了孕烯醇酮合成分泌。有研究发现，母牛产后乏情期雌二醇（Estradiol，E2）含量较妊娠期变化不大且处于较低水平，但孕酮（Progesterone，P4）含量升高[20]，因此推断孕烯醇酮作为激素原主要用于P4的合成。P4是调节卵巢机能的重要激素[21]，其调节作用具有浓度依赖性，低浓度能够促进卵泡发育，高浓度时反而对卵泡的发育有抑制作用[22]。促黄体素（Luteinizing hormone，LH）脉冲频率增加能够加强E2的分泌进而诱导LH 峰出现和排卵发生[23]，但P4则能抑制LH 的脉冲频率[24]。因此，产后乏情期，高浓度P4足以将LH 脉冲频率降低到一定程度，从而抑制卵泡波的出现，使得牦牛卵泡处于静止时期，卵泡波不能正常发育和排卵，进而诱发乏情的产生。

同时，有研究发现缓激肽（Bradykinin，BK）和缓激肽B2（Bradykinin B2 receptor，BKB2）受体在发情期前高表达，在发情期间急剧下降，并且推测变化与LH 的释放有关，证明BK 和BKB2 的水平与发情周期正相关[25]。本试验中，产后乏情期BK 较妊娠期表达下调，表明BK 在牦牛产后乏情病理过程中也发挥了一定的作用。

3.2 牦牛生殖周期的能量平衡

产后乏情期谷胱甘肽过氧化物酶1（Glutathione peroxidase 1，GSH-P1）、谷胱甘肽S-转移酶A2（Glutathione S-transferase A2，GSTA2）和天冬氨酸转氨酶（Aspartate amino transferase，AST）较妊娠期表达上调，谷胱甘肽转移酶（Glutathione transferase，GST）较妊娠期表达下调。通过KEGG 差异蛋白代谢通路分析发现GSH-P1、GSTA2、GST 参与GSH代谢。草食动物小肠内食源性外源氨基酸的生物吸收是依靠GSH 合成与分解时利用γ-谷氨酰基循环实现的，其吸收方式为主动转运[26,27]。GST 可催化GSH 形成含GSH 的结合物，结合物经消化道排出体外，产后乏情期GST 表达下调可通过减少GSH 的排出以加强γ-谷氨酰基循环，提高牦牛对饲草中外源氨基酸的吸收能力，继而减缓代谢的负平衡状态。AST 参与氨基酸的分解供能的开始阶段，其在产后乏情期表达上调，表明牦牛在产后糖代谢供能不足的情况下，更多的氨基酸通过转氨基作用转化为丙酮酸，进而参与三羧酸循环来弥补机体糖储量不足造成的能量负平衡。能量负平衡状态下机体优先从繁殖中转移营养能量[28]，并开始通过脂肪代谢和蛋白质代谢提供所需能量，这一状态容易诱发以卵巢静止为主的乏情过程[29]。有研究发现，牦牛在能量负平衡的状态下其生殖激素分泌模式会发生一定改变[30]，机体以降低自身代谢和增大存活几率为目的，生殖激素分泌减少，最终也会导致牦牛较长时间不发情。

3.3 牦牛卵巢原始卵泡激活

产后乏情期磷脂酰肌醇-3-激酶蛋白（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）较妊娠期表达下调，并且通过KEGG 差异蛋白代谢通路分析发现PI3K 参与PI3K/AKT（Protein kinase B）信号通路。PI3K/AKT 细胞凋亡信号通路是体内的基础信号通路[31]，对卵巢休眠[32]、初始卵泡激活[33]有重要意义，卵泡激活便是基于PI3K-AKT 信号通路实现的[34]。原始卵泡是雌性哺乳动物繁殖的基本功能单位[35]。进入卵泡池中的原始卵泡则有助于内分泌和排卵，并促进雌性生育[36]。因此，原始卵泡的休眠、死亡和激活之间的平衡对于维持适当的生殖寿命[37]和调控生殖进程极其重要[38]。PI3K-AKT 信号通路中，AKT 的激活导致通路下游分子磷酸化，使得卵泡激活[39]。本研究中，乏情期差异蛋白PI3K 表达下降，造成PI3K/AKT 信号通路负调控，其对于牦牛产后原始卵泡闭锁、退化以致乏情的产生具有一定的因果关系。

在本研究中还发现乏情期较妊娠期之间的其他差异表达蛋白还广泛存在于不同功能通路中，如次生代谢物的生物合成运输与分解、一般功能预测、碳代谢、复制重组和修复以及细胞吞噬等过程中，表明牦牛的产后乏情在分子层面上也可能与之相关，但具体如何影响，需要后期更深入的研究。

4 结论

本研究利用蛋白质组学技术筛选分析牦牛妊娠期和产后乏情期卵巢组织间的差异蛋白，发现牦牛产后乏情的出现与差异表达蛋白BK、P450scc 参与卵巢类固醇激素生成；GSH-P1、GSTA2、GST 和AST参与氨基酸转运与蛋白质代谢；PI3K 参与PI3K-Akt细胞凋亡有关。本研究有助于更好地分析理解牦牛妊娠分娩后易乏情的生理变化规律，对于深入研究牦牛妊娠期和产后乏情期卵巢的生理特性和揭示产后乏情期关键生物因子具有一定参考价值。