高效液相色谱-甲烷动态反应电感耦合等离子体质谱法测定谷物中痕量硒形态

周 娅，李 霞， 罗丽卉， 王 棚

(四川省农业科学院分析测试中心；农业农村部食品质量监督检验测试中心(成都),成都 610066)

硒是人体必需的微量元素，它是抗氧化防御系统和甲状腺激素代谢过程的重要组成部分，并具有许多生理功能，例如免疫调节特性和对重金属的拮抗作用[1-3]。人体不能自身合成硒，食物链是人体中硒的主要来源。植物和动物中的硒浓度基本上是由地质决定的，但是硒在土壤中的分布极其不均匀，中国大约51%的土壤中缺乏硒[4]，在中国中度硒缺乏地区，每天主要的硒摄入来源是肉类和谷物，分别占67.8%和22.6%[5]，通过生物强化生产富含硒的作物是增加缺硒地区居民硒摄入的一种安全有效的方法[6]。

硒的代谢途径、生物利用度、生理功能和毒性取决于摄入量和化学形式(物种)[7]。通常，硒的有机形式如硒代蛋氨酸(SeMet)，硒代半胱氨酸(SeCys)和甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)比无机硒具有更高的生物利用度和较低的毒性[8]。现行食品安全国家标准方法无法对硒的存在形态进行定性和定量分析，因此硒形态分析对谷物营养价值评价及安全风险评估具有至关重要的意义。

目前国内外在硒形态研究方面已有一些报道，其中HPLC-ICP-MS和HPLC-AFS联用技术是目前分析硒形态应用最多的两种方法。其中原子荧光检测需要紫外光辐照，其形态转化效率有待提高[9]；ICP-MS检测对硒丰度较大的同位素存在明显的多原子离子干扰(80Se丰度49.6%，但80Se易受到等离子气40Ar40Ar+的同量异位素干扰，无法进行测定)，现有文献基本均采用氦气碰撞降低部分干扰，只检测同位素78Se(丰度23.77%)或82Se(丰度8.73%)，但灵敏度较低，检出限较高，因此低硒样品中硒形态由于含量低而无法进行检测，进而限制了检测样品类型的范围[10-12]。本实验利用甲烷气体消除质谱干扰，测定丰度最大的同位素80Se，大幅度提高方法灵敏度，降低其检出限，同时对前处理提取方法以及流动相种类等条件优化，建立了谷物中5种硒形态的测定方法，以期为谷物类食品中不同硒物种的测定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富硒黑米、糙米、小米：市售。

硒单元素标准溶液(GBW(E)082114, 100 mg/L); 硒酸根Se(Ⅵ)(GBW10033, 75.1 μg/L)，亚硒酸根Se(Ⅳ)(GBW10032, 68.9 μg/L)、 硒代蛋氨酸SeMet (GBW10034,97.9 μg/L)、硒代胱氨酸SeCys (GBW10087, 93.5 μg/L)、甲基硒代半胱氨酸SeMecys (GBW10088, 96.6 μg/L);蛋白酶XIV; 柠檬酸、氨水、硝酸等其他化学试剂均为优级纯；色谱进样前所有样品都经0.22μm滤膜过滤。

1.2 仪器与设备

A-10型液相色谱仪，NexioN300D型电感耦合等离子体质谱仪，TOPEX+微波消解仪，PRP-X100 阴离子交换柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.3 样品前处理

1.3.1 总硒前处理

参照 GB 5009.268—2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》, 称取0.5 g样品置于消解内罐中, 加入8 mL 浓硝酸，放入微波消解仪消解，消解完毕后，再以180 ℃赶酸至罐内液体剩余1 mL左右，冷却后用超纯水少量多次定容至25 mL后上ICPMS, 同时做空白实验。

1.3.2 硒形态测定样品前处理

称取0.5 g(精确到0.001 g)， 溶解在10 mL Tris-HCl(100 mmol/L， pH7.4)中，加入蛋白酶XIV100 mg，在37 ℃下振荡酶解12 h。酶解后，以8 000 r/min离心10 min，取上清液 ，过0.22 μm滤膜后供HPLC-ICP-MS测定，同时做样品空白 。

1.4 仪器条件

液相色谱条件: PRP-X100 阴离子交换柱(250 mm×4.6 mm，5 μm); 流动相 为 5 mmol/L 柠檬酸(pH5.0)，流速为1.0 mL/min,进样量为100 μL。

ICP-MS 检测条件: RF 发射功率 1 500 W；辅助气流量1.2 L/min；等离子气流量18 L/min；雾化器流量0.89 L/min；采样锥：镍锥；雾化器：同心玻璃雾化器。

2 结果与分析

2.1 甲烷流量和反应池抑制参数Rpq值优化

Se在自然界中有74Se、76Se、77Se、78Se、80Se和82Se 6个同位素。74Se、76Se、77Se和82Se的丰度值较低，其信号值响应低；78Se和80Se的自然丰度大，信号较强，但等离子气体氩气电离时产生的38Ar40Ar+、40Ca38Ar+、41K37Cl+、39K39K+、40Ar40Ar+都会产生同量异位干扰，使检测硒的能力大大降低，导致检出限变差，甚至无法直接测定。本实验采用动态反应池(DRC)技术来降低此类干扰，以期为硒检测提供更高的灵敏度和更低的检测限。

动态反应池技术一般采用氧气、氨气、甲烷或者混合气作为反应介质降低或消除某些元素的质谱干扰。甲烷与80Se的主要干扰物40Ar40Ar+之间发生放热反应，并且具有较高的速率常数，故本研究采用甲烷作为反应气[13]。动态反应池技术主要由2个参数控制：反应气体流速和反应池抑制参数(Rejection Parameter q，Rpq)，后者用作低质量截止值，可以使得一定质量数以下的离子被剔除，降低背景噪声。本研究中反应气甲烷流量和反应池抑制参数Rpq值对80Se信号强度的影响见图1(基质空白为5 mmol/L柠檬酸，Se标准溶液质量浓度为1 μg/L)。随着甲烷流量从0.2 mL/min逐渐增加至1.0 mL/min，基体背景信号逐渐降低最后趋于稳定，当甲烷流量为0.6 mL/min时80Se信号噪声比最大；Rpq为0.5时，80Se信噪比最大。实验选择甲烷流量为0.6 mL/min，反应池抑制参数Rpq为0.5。

图1 甲烷流量和反应池抑制参数Rpq对基体空白和Se信号强度的影响

2.2 流动相类型的优化

阴离子交换色谱分离硒化合物常用流动相包含缓冲盐溶液(乙酸盐，柠檬酸或磷酸盐)和小部分(2%～5%)的有机改性剂(例如甲醇)[14-16]。本实验考察了磷酸氢二铵、乙酸铵、柠檬酸作为流动相对5种硒形态的分离情况的影响。结果表明：10 mmol/L乙酸铵(pH 5.2)作为流动相时，甲基硒代胱氨酸和亚硒酸根的峰形会发生重叠现象，不能有效分离；40 mmol/L磷酸氢二铵(pH 6.0)作为流动相时基本能分离5中硒形态，但硒代蛋氨酸灵敏度低，硒酸根出峰时间为26 min，分离耗时较长，信号强度较弱；5 mmol/L柠檬酸(pH 5.0)作为流动相时，有机硒和无机硒分离效果较好(见图2)，这与姚真真等[12]的研究结果一致。本研究选择5 mmol/L柠檬酸(pH 5.0)作为流动相，5种硒形态在20 min内达到基线分离，且峰形与信号较好。

注：a流动相为10 mmol/L乙酸铵(pH5.2)；b流动相为40 mmol/L磷酸氢二铵(pH6.0)；c流动相为5 mmol/L柠檬酸(pH5.0)。图2 流动相种类对硒形态分离的影响

2.3 样品中硒形态提取条件的优化

食品中硒形态的提取主要方式为液相萃取、液相微萃取和固相微萃取等[17,18]。提取过程中不同形态的硒很容易受到提取介质的影响发生转变或损失，因此从食品基质中提取硒不同形态的技术关键在于能否显著提高样品提取效率。本研究对比了液相萃取中蛋白酶用量和提取时间对硒形态提取效率的影响。

本研究考察了富硒黑米中加入蛋白酶XIV20、40、60、80、100 mg时样品的提取效率，结果见表1。研究结果表明：黑米样品中5种硒形态主要检出硒代胱氨酸(SeCys)和硒代蛋氨酸(SeMet)，蛋白酶XIV的加入量直接影响SeMet的提取量；加入蛋白酶XIV20 mg时，样品的提取效率仅为39.0%，酶加入量增加后，提取效率显著提高。加入100 mg时，提取效率能达到90%，所以本实验选择加入100 mg蛋白酶XIV。

表1 蛋白酶XIV用量对硒形态提取效率的影响

本研究优化了不同提取时间对提取效率的影响。分别研究了37 ℃振荡提取时间 8、 12、 24、48 h对硒形态提取效率的影响。实验结果表明：当提取时间为8 h时，提取效率只有70%；当提取时间逐渐延长，提取效率升高；当提取时间为12 h和24 h时，提取效率变化不大，均达到了90%；提取时间为48 h时，有很大的杂峰，怀疑提取时间过长硒形态发生了转变。本研究提取时间选择为12 h。

2.4 线性关系及检出限

使用本实验优化的条件进行检测，硒代胱氨酸(SeCys)、甲基硒代半胱氨酸(SeMecys)、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒酸根Se(Ⅵ), 亚硒酸根Se(Ⅳ)的线性范围为0.50～50 μg/L，线性相关系数(R2)均大于0.999 9，以3倍信噪比计算检出限，硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、亚硒酸根、硒代蛋氨酸、硒酸根的检出限分别为0.01、0.05、0.05、0.20、0.10 μg/L，比相关研究的检出限均低[10-12,19,20]。5种硒形态的线性范围、线性方程、相关系数和检出限见表2。

表2 5种硒形态的线性范围、线性方程、相关系数和检出限

2.5 方法回收率与精密度

选取富硒黑米样品进行加标回收和精密度实验。按 1.3.2 方法处理样品，黑米中5种硒形态仅检出了硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸，其余形态均未检出。对黑米样品进行低、中、高3 个浓度水平的加标回收实验, 每个水平平行测定6次，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)。 结果表明, 5 种硒形态的加标回收率88.5%～105.0%，相对标准偏差为1.1%～4.4%, 说明本方法具有良好的准确度和精密度(见表3)。

2.6 实际样品分析

使用HPLC-DRC-ICP-MS方法分析了市售糙米、黑米、小米中5种硒形态，结果见表4。结果发现，谷物中的硒含量差异较大，糙米和黑米中的硒成分以硒代蛋氨酸(SeMet)为主，含有少量硒代半胱氨酸SeCys，小米中硒的成分全部以硒代蛋氨酸(SeMet)的有机形态存在。使用本方法的提取程序，谷物样品中有机硒含量占总硒含量的87.5%～91.5%，这说明富硒谷物中含有丰富的有机硒成分，可作为良好的补硒产品。

表3 黑米中5种硒形态的加标回收率和精密度(n=6)

表4 市售谷物中的5种硒形态测定结果

3 结论

利用恒温振荡辅助酶萃取进行样品前处理，建立了HPLC-DRC-ICPMS联用技术测定谷物中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、亚硒酸根、硒代蛋氨酸、硒酸根5种常见硒形态的分析方法。该方法操作简单、灵敏度高、精密度和准确度良好，为各类谷物样品中的硒形态分析提供了一种简单而灵敏的测定技术。