二硫化碳对不同磷化氢抗性赤拟谷盗毒力、呼吸和解毒酶活性的影响

何文强， 李丽， 李柏树， 张广平， 张俊争， 刘涛

1.中国农业大学 植物保护学院，北京 100193；2.中国检验检疫科学研究院 装备技术研究所，北京 100020

磷化氢(PH3)熏蒸作为防治仓储害虫的主要手段，已经在世界范围内应用了近60年[1-2]．但是由于大规模、不规范地使用磷化氢，许多仓储害虫已经对磷化氢产生了一定的抗药性[3-5]．目前，高磷化氢抗性的仓储害虫在世界各地均有报道，如澳大利亚多个地区的锈赤扁谷盗(Cryptolestesferrugineus)的磷化氢抗性倍数均达到400倍以上[6]，从美国不同地区收集的赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)中发现有磷化氢抗性倍数达127倍的种群[7]；在我国的福建、海南、山东、广东、湖南等地区收集的赤拟谷盗、锈赤扁谷盗和谷蠹(Rhizoperthadominica)对磷化氢均有抗性，最高抗性可达1 173.6倍[8-9]．

随着仓储害虫对磷化氢的抗性逐步增强，用磷化氢防治仓储害虫的成本也越来越高．因此，国内外的研究者急于寻找一种替代性熏蒸剂来减少对磷化氢的依赖性．Jagadeesan R等[10-11]的研究表明，在几种主要的仓储害虫中，硫酰氟(SF)和磷化氢之间均不存在交互抗性．研究者们也在逐步探索甲酸乙酯(EF)[12-13]等药剂能否充当磷化氢的替代品，或者能否减少对磷化氢的依赖．虽然对硫酰氟、甲酸乙酯等替代性熏蒸剂的开发，能够减轻对磷化氢的依赖，但是前人的研究表明，硫酰氟在熏蒸处理过程中，需要非常高的浓度才能够杀死害虫的卵，相比于磷化氢熏蒸处理更加昂贵[14]，并且在硫酰氟熏蒸处理之后会留下氟化物残留[15-16]；而甲酸乙酯的吸附性很强，在投药之后浓度会急剧下降，并且对一些水果、蔬菜具有较高的植物毒性[17-18]．

二硫化碳(CS2)是一种非常好的熏蒸剂，曾被用于熏蒸苹果蠹蛾，与溴甲烷相比毒性较低，价格也比溴甲烷低，且熏蒸之后在水果上的残留量较低，安全范围较大，不易产生药害[19]．二硫化碳与四氯化碳混合熏蒸防治仓储害虫谷蠹的效果也非常好，并且在粮食中也能保持低毒低残留的特性，熏蒸过后毒气残留远低于允许残留标准[20]．二硫化碳还用于熏蒸苗木[21]、牧草种子[22]和巢脾[23]，在防治红苕黑斑病上也有不错的效果[24]．但是二硫化碳的沸点为46.3 ℃，空气中燃烧极限为1.25%～44%，闪点约20 ℃，在100 ℃左右能自燃[25]，因为其易燃易爆炸的特性，不能够长期、大面积地使用．近年来，随着人工制氮技术的突破，氮气作为稀释气体与二硫化碳混合使用能够克服二硫化碳易燃易爆的特点，再加上熏蒸剂的安全投药技术提高，在实际操作中能够对二硫化碳安全使用，因此，本试验开展了对使用二硫化碳解决磷化氢抗性问题的探索．

赤拟谷盗是一种非常重要的仓储害虫，属鞘翅目、拟步甲科，食性较为广泛，为害严重，除直接为害以外，还可以分泌一些有毒物质，严重影响粮食质量和粮食安全[13-14]．本试验以不同品系的赤拟谷盗成虫为试虫，在测定各个品系的磷化氢抗性的基础上，研究了二硫化碳对不同磷化氢抗性品系赤拟谷盗的毒力以及解毒酶活性的影响，为深入探索二硫化碳的杀虫机理提供基础，并且为解决磷化氢抗性问题以及有效防治仓储害虫提供理论依据．

1 材料与方法

1.1 试验虫源

赤拟谷盗的饲养方法参照赵娜娜等[26]的方法，4种品系的赤拟谷盗初始种群分别采集于我国山东齐河(QH)、广东深圳(SZ)、山东淄博(ZB)以及澳大利亚(AU)4个地区，采用活性酵母和全麦面粉混合(质量比为1∶9)，在温度(25±1) ℃，相对湿度65%～75%条件下避光饲养，挑选发育健康、活动能力强的成虫作为供试虫源．

1.2 试剂与仪器

磷化氢(PH3)标准气(1.02%)购自北京北氧特种气体研究所，二硫化碳(CS2)采购于北京伊诺凯科技有限公司，羧酸酯酶(CarE)试剂盒、乙酰胆碱酯酶(AChE)试剂盒采购于南京建成生物工程研究所，细胞色素P450(CYP450)试剂盒采购于上海江莱生物科技有限公司．

气相色谱仪：安捷伦6890N，美国安捷伦公司生产；紫外分光光度计：U-3310，日本日立公司生产；高速冷冻离心机：5417R，德国Eppendorf公司生产；酶标仪：Spectra Max i3，美谷分子仪器(上海)有限公司生产．

1.3 赤拟谷盗各品系对磷化氢的抗性测定

根据联合国粮食及农业组织(FAO)推荐的熏蒸剂毒力测定方法，将150头体型相似且活动能力强的赤拟谷盗成虫密封于容积为6 L的熏蒸罐内，用气密性良好的注射器注射磷化氢气体，进行熏蒸处理．具体投药浓度和熏蒸条件见表1．

表1 4种品系赤拟谷盗的磷化氢熏蒸浓度与条件

熏蒸结束后，在通风橱内进行散气，散气后取出试虫，在饲养条件下放置7 d．记录试虫的死亡数量(死亡标准为使用毛笔或者解剖针触动背部试虫无反应[27])，计算死亡率[28]．各处理均重复3次，且根据磷化氢抗性水平判断指标[29]判断4种品系的抗性水平．抗性系数1～5表示抗性水平为敏感，抗性系数5～10表示抗性水平为低抗，抗性系数10～40表示抗性水平为中抗，抗性系数40～160表示抗性水平为高抗，抗性系数160以上表示抗性水平为极高抗．

1.4 二硫化碳对赤拟谷盗毒力测定

将30头体型相似且活动能力强的赤拟谷盗成虫密封于6 L的熏蒸罐内，熏蒸罐底部放置小风扇，投药过后打开风扇使二硫化碳充分挥发且循环均匀，设定二硫化碳熏蒸浓度为40，50，60，70，80，90，100，110，120 g/m3．在25 ℃，相对湿度(70±5)%条件下熏蒸处理4 h．熏蒸结束后，在通风橱中散气，散气后取出试虫，在饲养条件下放置48 h．记录试虫的死亡数量(死亡标准为使用毛笔或者解剖针触动背部试虫无反应)，计算死亡率．以上各处理均重复3次，以未熏蒸的试虫作为对照．

1.5 赤拟谷盗体内解毒酶以及蛋白含量的测定

将不同品系的赤拟谷盗在LD50的二硫化碳浓度下熏蒸4 h，散气2 h后，以5头成虫一组分装入离心管中并立即放入液氮，在液氮里放置5 min以上，未熏蒸的试虫作为对照组，置于-80 ℃冰箱中保存．将试虫称质量，按质量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例，加入9倍体积4 ℃预冷的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，12 000 r/min离心10 min，收集上清液作为酶源．根据羧酸酯酶(CarE)试剂盒、乙酰胆碱酯酶(AChE)试剂盒，细胞色素P450(CYP450)试剂盒说明书分别测定试虫的酶活[30]．

总蛋白含量测定使用考马斯亮蓝染液和牛肉清白蛋白(BSA)标准溶液，参照Bradford考马斯亮蓝G-250法[31]进行测定．

1.6 熏蒸处理对赤拟谷盗呼吸强度的影响测定

呼吸强度的测定参照张凡华等[32]的方法，将30头试虫放在250 mL密封玻璃瓶中，以LD50浓度的CS2熏蒸4 h，分别在熏蒸开始以及熏蒸结束时测定玻璃瓶中CO2浓度．散气后在25 ℃、相对湿度(70±5)%、黑暗的条件下放置24 h，之后将试虫放置到250 mL的密封玻璃瓶中，再测定玻璃瓶中0 h，1 h的CO2浓度，将熏蒸处理的试虫作为处理组，未熏蒸处理的试虫作为对照组．对照组的呼吸强度测定：未熏蒸的30头试虫在密封玻璃瓶中，测定玻璃瓶中0 h和 1 h时的CO2浓度，计算其呼吸强度；熏蒸过程中呼吸强度测定：将30头试虫放入密封的玻璃瓶中进行熏蒸，在熏蒸过程中测定玻璃瓶中0 h和结束时的CO2浓度，并计算呼吸强度；熏蒸后的呼吸强度测定：将熏蒸过后，且饲养条件下放置24 h的试虫再放置到密封玻璃瓶中，测定玻璃瓶中0 h和1 h的CO2浓度，并计算呼吸强度．呼吸强度以单位mL/h/个表示．

呼吸强度=(最终CO2浓度-初始CO2浓度)/(熏蒸时间×试虫个数)

1.7 数据分析

采用Microsoft Excel统计整理相关试验数据，用SPSS 23.0版本Duncan氏检验法对相关指标进行差异显著性分析，处理与对照之间的差异显著性采用t测验，用POLO Plus软件进行毒力分析．

2 结果与分析

2.1 赤拟谷盗各品系磷化氢抗性测定

根据FAO推荐的方法[21]测定4种品系对磷化氢的抗性水平，与Jagadeesan R等[10]测定的敏感品系进行比较．结果可知，AU品系抗性最低，LD50为0.033 mg/L，抗性倍数为7.1倍；QH品系的抗性其次，LD50为0.175 mg/L，抗性倍数为38.1倍；而ZB品系的抗性较高，LD50为2.110 mg/L，抗性倍数为458.6倍；SZ品系的抗性最强，LD50为4.701 mg/L，抗性倍数为1 022.0倍．根据磷化氢抗性水平判断指标判断4种品系中AU为低抗品系，QH为中抗品系，ZB和SZ为极高抗品系(表2)．

表2 磷化氢熏蒸处理对4种赤拟谷盗品系的毒力

2.2 二硫化碳对赤拟谷盗各品系的毒力测定

试验结果看出，二硫化碳熏蒸对AU，QH，ZB，SZ品系的LD50分别为89.14，96.43，85.64，84.64 g/m3．4种不同磷化氢抗性水平的赤拟谷盗在二硫化碳熏蒸之后，AU，ZB，SZ品系LD50的置信区间均有重合．因此可以看出不同抗性品系的赤拟谷盗对二硫化碳的敏感性是基本相似的，磷化氢和二硫化碳之间没有明显的交互抗性(表3)．

表3 二硫化碳熏蒸处理对4种赤拟谷盗品系的毒力

2.3 二硫化碳熏蒸对赤拟谷盗呼吸强度的影响

试验结果看出，在对照组中，低抗品系AU呼吸强度最高，和其他3种抗性品系间差异有统计学意义，可以看出，在抗性品系之中，呼吸强度会降低．在使用二硫化碳熏蒸赤拟谷盗的过程之中，4种品系的呼吸强度相比较于对照组均有所降低，但各处理组间差异无统计学意义．在熏蒸之后，4种品系相比较于对照组，呼吸强度均有增高．处理组相比对照组，AU品系提高2.2倍，QH和ZB品系提高1.9倍，SZ品系提高2.1倍．4种品系处理前后呼吸强度增加倍数差异无统计学意义(F3，11=1.11，p=0.40)．说明4种品系在呼吸层面对二硫化碳的响应是一致的(图1)．

2.4 二硫化碳处理后对赤拟谷盗体内CarE活性的影响

对比对照组中4种品系的赤拟谷盗体内CarE活性水平，结果发现，ZB品系的酶活性最高，高于AU，QH，SZ 3个品系，且差异有统计学意义；QH品系显著高于SZ品系，而AU品系和QH，SZ品系之间差异无统计学意义；对比4种品系的磷化氢抗性水平，CarE活性和抗性水平之间无相关性．处理组中，QH品系活性最高，高于AU，SZ品系且差异有统计学意义；ZB品系明显高于SZ品系，AU品系与SZ和ZB品系之间差异无统计学意义．在同一品系的处理和对照之间，经过LD50的二硫化碳熏蒸处理前后，所有品系的CarE活性均显著提高．其中SZ品系CarE活性提高最多，相比于对照组提高了4.12倍；其次是AU，QH品系的酶活性，分别提高了3.3倍和3.2倍；最后是ZB品系，提高了2.12倍(图2)．

“CK”为空白对照，“处理中”表示熏蒸过程中，“处理后”为熏蒸结束24 h之后；小写字母不同表示不同品系间差异有统计学意义(p<0.05)．图1 二硫化碳处理对赤拟谷盗呼吸强度的影响

小写字母不同表示不同品系间差异有统计学意义(p<0.05)，大写字母不同表示未处理的不同品系间差异有统计学意义(p<0.05)“*”表示同一品系空白对照与处理间差异有统计学意义(p<0.05)．图2 二硫化碳处理对赤拟谷盗CarE活性的影响

2.5 二硫化碳处理后对赤拟谷盗体内P450s活性的影响

试验结果可以看出，对照组中，QH品系P450s活性最高，高于AU，ZB，SZ 3个品系且差异有统计学意义；SZ品系酶活性高于AU，ZB两个品系，差异有统计学意义，而AU和ZB酶活性之间差异无统计学意义．处理组中，AU，QH，SZ 3个品系之间差异无统计学意义，但均显著高于ZB品系．在同一品系的处理和对照之间，经过LD50的二硫化碳熏蒸处理前后，AU品系的P450s活性显著增高，相比较于对照组提高到1.08倍，而QH，ZB 2个品系的赤拟谷盗相比于对照组P450s的活性均显著降低，ZB品系相比较于对照组下降到0.93倍，QH品系相比较于对照组下降到0.81倍，SZ品系无显著性差异(图3)．

2.6 二硫化碳处理后对赤拟谷盗体内AChE活性的影响

试验结果看出，对照组中SZ，AU，ZB，QH 4种品系酶活有差异，且差异均有统计学意义；处理组中，SZ品系AChE的活性最高，与AU，ZB，QH之间差异均有统计学意义，AU，ZB 2个品系之间AChE的活性差异无统计学意义，但均高于QH品系．在同一品系的处理和对照之间，经过LD50的二硫化碳熏蒸处理前后，AChE的活性相比较于对照组均有显著提高，其中ZB品系的AChE活性提高的最多，相比较于对照组提高到1.99倍，其次是QH品系，酶活性水平提高到1.49倍，AU和SZ品系提高较少，分别提高到1.27倍和1.33倍(图4)．

小写字母不同表示不同品系间差异有统计学意义(p<0.05)，大写字母不同表示未处理的不同品系间差异有统计学意义(p<0.05)，“*”表示同一品系空白对照与处理间差异有统计学意义(p<0.05)，ns表示无显著性差异．图3 二硫化碳处理对赤拟谷盗P450s活性的影响

小写字母不同表示不同品系间差异有统计学意义(p<0.05)，大写字母不同表示未处理的不同品系间差异有统计学意义(p<0.05)，“*”表示同一品系空白对照与处理间差异有统计学意义(p<0.05)．图4 二硫化碳处理对赤拟谷盗体AChE活性的影响

3 结论与讨论

利用磷化氢防治仓储害虫已有超过60年的历史，随着仓储害虫抗药性的产生，磷化氢的防治效果也越来越差[32-34]．因此探索新型的熏蒸剂来减少对磷化氢的依赖性非常重要．之前的研究表明，硫酰氟与磷化氢并无交互抗性作用，能够作为防治磷化氢抗性的一种替代药剂[10-11]；臭氧[35]、甲酸乙酯[12-13]等同样也可以作为对抗磷化氢抗性的可选择熏蒸剂；而二硫化碳作为一种熏蒸剂，具备穿透性好、杀虫效果好等特点，能够有效地防治赤拟谷盗等仓储害虫[36]．本试验旨在探索二硫化碳与磷化氢是否具有交互抗性，并探索二硫化碳处理后赤拟谷盗代谢以及解毒酶的变化，从而判断二硫化碳能否可以成为对抗磷化氢抗性的一种新药剂．

本试验首先通过FAO推荐的测定磷化氢抗性的方法，根据Jagadeesan R等[10]测定的敏感品系，得出AU品系的抗性倍数为7.1，QH品系的抗性倍数为38.1，ZB品系的抗性倍数为458.6，SZ品系的抗性倍数为1 022.0，能够覆盖低抗、中抗、极高抗3个等级．本试验中二硫化碳毒力数据LD50的CT值(熏蒸时间×熏蒸浓度)分别是AU为356.56 mg·h/L，QH为385.72 mg·h/L，ZB为342.56 mg·h/L，SZ为338.56 mg·h/L．根据Jagadeesan R等[10]测定的数据，使用硫酰氟熏蒸2种不同抗性水平的赤拟谷盗，LD50的CT值分别为6.72 mg·h/L和8.16 mg·h/L．根据唐培安等[37]测定的数据，使用甲酸乙酯熏蒸赤拟谷盗，LD50的CT值为660.38 mg·h/L，因此可以看出二硫化碳对于仓储害虫成虫杀虫效果低于硫酰氟，高于甲酸乙酯．

本试验测定了4种不同品系赤拟谷盗熏蒸前后的呼吸强度，在熏蒸之前可以看出，低抗品系的呼吸强度高于抗性品系的呼吸强度，这与Price等[38]的研究结果相似．而在熏蒸过程中赤拟谷盗的呼吸强度降低，并且各个品系之间差异无统计学意义，而在熏蒸之后4种品系的呼吸强度均有明显提高，说明在熏蒸之后赤拟谷盗体内的整体代谢水平提高，以对抗二硫化碳对自身的伤害．

解毒酶对杀虫剂的代谢解毒能力是研究昆虫对杀虫剂胁迫相应机制的主要途径之一．本试验还测定了4种不同磷化氢抗性品系的赤拟谷盗体内解毒酶的表达水平．研究结果发现，P450s的活性在二硫化碳处理前后低抗AU品系P450s活性显著升高，而中、高抗品系QH，SZ品系P450s活性显著降低，此结果与HUANG等[39]以亚致死浓度磷化氢处理赤拟谷盗后敏感品系P450s活性显著降低、而抗性品系P450s活性显著升高的结果对比，说明磷化氢与二硫化碳的杀虫机理不同，也进一步论证了二硫化碳和磷化氢之前没有交互抗性，并与其试验结论赤拟谷盗中P450s活性与磷化氢抗性水平有关相似．本试验4种品系赤拟谷盗中CarE和AChE活性在经过二硫化碳处理后均显著提高；而在唐培安等[37]的研究中，使用甲酸乙酯熏蒸处理米象后，米象体内的AChE和CarE活性显著降低；徐丽[40]的研究也表明，甲酸乙酯能够抑制酯酶的活性和AChE的活性，说明二硫化碳的杀虫机理和另一种磷化氢的替代性熏蒸剂甲酸乙酯的杀虫机理也是不同的．处理前后3种酶均有显著性变化，AChE，CarE，P450s 3种解毒酶能够参与赤拟谷盗对二硫化碳的代谢过程．

替代性熏蒸剂的筛选在国内外已经做了较多的研究，其中最重要的2种是硫酰氟和甲酸乙酯．硫酰氟已经被证实与磷化氢之间没有交互抗性[11]，并且，硫酰氟在熏蒸处理赤拟谷盗上也能够有很好的效果[41]．但是硫酰氟熏蒸的缺点也同时限制了其大规模推广使用，首先硫酰氟熏蒸完全杀死卵所需要的浓度较高，其次，在温度低于25 ℃，硫酰氟的熏蒸效果会大大削减[10-11]，这就导致使用硫酰氟熏蒸处理时所需要的成本比使用磷化氢高许多．另一种熏蒸剂甲酸乙酯也是一种非常常见的替代性熏蒸剂，被证实可以有效地熏蒸干果和谷物[42-44]以及西花蓟马[43]、烟蓟马[45]等有害生物，但有报道指出，甲酸乙酯虽然熏蒸时间较短，但是能够对许多植物和水果包括南瓜、香蕉、香菜等造成损伤[46-47]．而本试验用的二硫化碳，根据徐国淦等[19]的研究表明，其在熏蒸水果的过程之中，不易造成药害及对外观及品质等的影响；虽然该药毒性较低，但是穿透效果较好[36]，并且从效率和成本上来说二硫化碳是最有效的粮食熏蒸剂之一．目前国内外还没有关于氮气与二硫化碳混合使用的报道，但在实际应用中氮气与磷化氢混合技术已经成熟[47]，使用氮气不但能够实现更安全地投药，而且还有一定的增效效果，因此之后可以探索氮气与二硫化碳混合技术．总之，开发出一种类似于溴甲烷或者磷化氢的广谱性熏蒸剂是非常困难的，在这种情况下，不同替代性熏蒸剂的开发往往是针对于特定水果、特定昆虫和特定食品的．本试验针对仓储害虫，利用二硫化碳熏蒸处理不同磷化氢抗性的赤拟谷盗，发现二硫化碳与磷化氢之间没有交互抗性，为对抗仓储害虫磷化氢抗性的发展提供了新的思路．