总评归一法结合响应面法优化补肾强筋丸提取工艺△

崔旭辉，尚佳，李喜香*，陈国华，周婷婷，刘永昌

1.甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中医院 药学部，甘肃 兰州 730050；3.甘肃省疾病预防控制中心，甘肃 兰州 730000

补肾强筋丸是清代医家钱寿昌经验方——补肾壮筋汤随症加减而成，目前临床主要用于治疗骨质疏松型氟骨症[1-2]，疗效较好。研究表明，氟骨症已经长时间困扰全球大部分贫困地区的居民[3]，而中医认为，此类病症属于“骨痹”和“筋痹”范畴[4]。故全方由熟地黄、山茱萸、当归等10 味中药组成，其中熟地黄、山茱萸补益肝肾、益精填髓；杜仲、续断、五加皮强筋健骨、疗伤续折；当归、白芍、川牛膝补血活血、柔肝止痛；茯苓、青皮行气健脾，诸药合用，共奏补肾强筋功效。

目前，补肾壮筋方以汤剂入药，但汤剂作为传统剂型存在煎煮繁琐、携带困难、口感不佳等缺点，故本课题组拟将其开发为稳定性高、服药和携带方便的浓缩丸剂。经过前期相关文献调研发现，方中君药熟地黄中的指标成分毛蕊花糖苷已经改为地黄苷D，并且测定地黄苷D 成分含量的文献较少，在当前中药复方成分含量测定成为热点的前提下，多指标、多成分的测定已成为共识[5-7]。故本研究将地黄苷D、马钱苷、莫诺苷、阿魏酸的含量及浸膏得率一同作为考察指标，最后采用多指标总评归一法结合响应面法对补肾强筋丸提取工艺的参数进行优化，得到最佳提取工艺参数，以期为该浓缩丸剂提取工艺的优化提供参考。

1 材料

1.1 仪器

ACQUITY ARC 型高效液相色谱仪，配置四元溶剂管理器、FTN-R 型样品管理器、2998 型二极管阵列检测器（美国Waters 公司）；KQ-300DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；98-1-BN 型电热套（天津泰斯特仪器有限公司）；HH-6型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；SECURA125-1CN 型十万分之一天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；Elix Essential 5 型纯水机（德国默克公司）；RE3000B 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；ZXFD-A5140 型鼓风干燥箱（上海智城分析仪器制造有限公司）。

1.2 试药

对照品地黄苷D（批号：L16J11Y118585，纯度：98%）、马钱苷（批号：P22F10F81444，纯度：98%）、莫诺苷（批号：P11M11F112846，纯度：97%）、阿魏酸（批号：L03A9D57744，纯度：98%）均购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈为色谱纯（德国默克公司）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

药材熟地黄（批号：191214）、山萸肉（批号：200803）、当归（批号：190812）、杜仲（批号：190501）、川牛膝（批号：200101）、茯苓（批号：200704）、白芍（批号：191109）、续断（批号：200404）、青皮（批号：191210）、五加皮（批号：20200701）均购自甘肃康乐药业有限责任公司，经甘肃省中医院李喜香主任中药师鉴定为正品，均符合《中华人民共和国药典》2020 年版（一部）项下有关规定。

2 方法与结果

2.1 提取液的制备

按处方称取药材55 g于圆底烧瓶中，加水550 mL，浸泡30 min，加热回流60 min，提取2 次，4 层纱布滤过，得水提液，减压浓缩并定容至55 mL，即得。

2.2 莫诺苷、马钱苷、阿魏酸的含量测定

2.2.1 色谱条件 Waters Sun Fire C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～7 min，5%～6%A；7～8 min，6%～10%A；8～20 min，10%～16%A；20～30 min，16%～20%A；30～36 min，20%～25%A；36～39 min，25%～5%A；39～44 min，5%A）；体积流量：1.0 mL·min–1；进样量：10 μL；柱温：28 ℃；检测波长：252 nm。

2.2.2 混合对照品溶液制备 精密称取莫诺苷、马钱苷、阿魏酸对照品适量于5 mL 量瓶中，加甲醇制成质量浓度分别为1.121、1.042、0.560 mg·mL–1的莫诺苷、马钱苷、阿魏酸对照品储备液，精密吸取适量，置于同一5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，即得莫诺苷、马钱苷、阿魏酸质量浓度分别为0.448、0.416、0.031 mg·mL–1的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备 精密量取2.1 项下提取液5 mL 于蒸发皿中，水浴蒸干。加甲醇溶解，定容至25 mL，超声40 min。混匀后用0.2 μm 的微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.2.4 阴性样品溶液制备 按照处方工艺分别制得缺山茱萸、当归的阴性样品，按2.1及2.2.3项下方法制备，即得。

2.2.5 专属性试验 取混合对照品、供试品、阴性样品溶液适量，按2.2.1 项下条件进样测定，结果见图1。由图1可知，各成分均能达到基线分离（分离度>1.5），阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 补肾强筋丸中莫诺苷、马钱苷、阿魏酸的HPLC图

2.2.6 线性关系考察 分别精密量取混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇定容，制成质量浓度分别为4.48、8.96、22.40、35.84、44.80 μg·mL–1的莫诺苷对照品溶液，4.16、8.32、20.80、33.28、41.60 μg·mL–1的马钱苷对照品溶液，0.31、0.62、1.54、2.46、3.10 μg·mL–1的阿魏酸对照品溶液，分别精密吸取10 μL，按2.2.1 项下色谱条件进样测定。以各成分质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1。

表1 补肾强筋丸中莫诺苷、马钱苷、阿魏酸线性关系

2.2.7 精密度试验 取混合对照品溶液适量，按2.2.1项下色谱条件进样测定6 次，测得莫诺苷、马钱苷、阿魏酸峰面积RSD 分别为2.12%、2.65%、1.37%，表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于2、4、6、8、12、24 h 按2.2.1 项下色谱条件进样测定，测得莫诺苷、马钱苷、阿魏酸峰面积RSD 分别为2.01%、2.85%、1.92%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.9 重复性试验 取同一提取液，按2.2.3 项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，测得莫诺苷、马钱苷、阿魏酸含量RSD 分别为1.91%、2.44%、1.37%，表明该方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 精密吸取3 个成分含量已知的供试品溶液1.0 mL，共9 份，每3 份为一组，分别按低（80%）、中（100%）、高（120%）3 个水平精密加入2.2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.2.3 项下方法制成供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表2。

表2 补肾强筋丸中莫诺苷、马钱苷、阿魏酸加样回收率试验结果

2.3 地黄苷D含量测定

2.3.1 色谱条件 Waters Sun Fire C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.1%磷酸水溶液（5∶95）；体积流量：1.0 mL·min–1；进样量：10 μL；柱温：28 ℃；检测波长：203 nm。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取地黄苷D 对照品适量于5 mL 量瓶中，加甲醇制成质量浓度为0.925 mg·mL–1的地黄苷D 对照品储备液，精密吸取适量，置于同一5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得质量浓度为0.183 mg·mL–1的地黄苷D 对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液制备 精密量取2.1 项下提取液5 mL 于蒸发皿中，水浴蒸干。加甲醇溶解，定容至25 mL，超声40 min。混匀后用0.2 μm 的微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.3.4 阴性样品溶液制备 按处方工艺，制得缺熟地黄的阴性样品，按2.1 及2.3.3 项下方法制备，即得。

2.3.5 专属性试验 取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液适量，按2.3.1 项下色谱条件进样测定，结果见图2。由图2可知，各成分均能达到基线分离（分离度>1.5），表明该方法专属性良好。

图2 补肾强筋丸中地黄苷D的HPLC图

2.3.6 线性关系考察 精密量取地黄苷D 对照品溶液0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇定容，制成质量浓度分别为1.83、3.66、9.15、14.46、18.30 μg·mL–1的地黄苷D 对照品溶液，精密吸取10 μL，按2.3.1 项下色谱条件进样测定。以各成分质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，Y=10 191X–3 277.5（r=0.999 7），在1.83～18.30 μg·mL–1线性关系良好。

2.3.7 精密度试验 取对照品溶液适量，按2.3.1项下色谱条件进样测定6 次，测得地黄苷D 峰面积RSD为2.51%，表明仪器精密度良好。

2.3.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于2、4、6、8、12、24 h 按2.3.1 项下色谱条件进样测定，测得地黄苷D 峰面积RSD 为2.29%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.9 重复性试验 取同一份提取液，按2.3.3 项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件进样测定，测得地黄苷D 含量RSD 为2.66%，表明该方法重复性良好。

2.3.10 加样回收率试验 精密吸取地黄苷D 含量已知的供试品溶液1.0 mL，共9 份，每3 份为一组，分别按低（80%）、中（100%）、高（120%）3 个水平精密加入2.3.2项下对照品溶液适量，按2.3.3项下方法制成供试品溶液，按2.3.1 项下色谱条件进行测定，测得地黄苷D 平均加样回收率为100.21%，RSD为1.86%。

2.4 浸膏得率的测定

准确吸取2.1 项下提取液5 mL，置已干燥至质量恒定的蒸发皿中，水浴蒸干后，烘箱中105 ℃干燥3 h，移至干燥器中冷却至室温，迅速精密称定质量，按公式（1）计算干浸膏提取率[8]。

2.5 工艺优化

2.5.1 单因素试验 通过前期查阅相关文献可知，对于大多数苷类成分来说，水提比醇提效果更好[9]，结合本剂型通常不采用醇提[10]，故本研究采用水提。筛选提取次数、浸泡时间、提取时间、溶剂量，按2.1 项下方法制备提取液，进行考察，结果见图3。由图3 可知，提取数为1～2 次时4 个成分提取量增长较为急剧，而2～3次时较缓，甚至下降，并且提取次数为非连续变量，无法进行回归处理，故将其固定为2次；浸泡时间为45 min时4个成分提取量最高，故选择30～60 min进行考察；提取时间为30～60 min时4个成分提取量增加较缓，60～90 min时增加较快，随后又逐渐下降减缓，故选择60～120 min 进行考察；溶剂量为10 倍时4 个成分提取量达到最高并逐渐变缓，故选择8～12倍水进行考察。

图3 补肾强筋丸提取工艺单因素试验结果

2.5.2 中心组合设计-响应面法 在单因素试验结果基础上，将浸泡时间（A）、提取时间（B）、溶剂量（C）作为考察因素[11-12]，以地黄苷D、马钱苷、莫诺苷、阿魏酸含量和浸膏得率的总评归一值（OD值）作为响应值进行综合评分，通过Hassan 法[13]对各指标进行归一化处理，由于本研究要求各指标成分含量越大越好，故选择公式（2）计算各指标OD值。

其中，di为各指标的OD 值，Yi为指标测定值，Ymax、Ymin分别为各指标在20 次实验中的最大值、最小值；OD=（d1d2……dn）1/n，其中n为所选取的指标数。设计三因素五水平试验，因素水平见表3。

按处方比例称取药材共55 g，按表3 参数加热回流提取2次，减压浓缩至55 mL，测定提取液中各指标成分含量及浸膏得率，计算OD 值，结果见表4。

表3 补肾强筋丸提取工艺响应面试验因素水平

运用Design Expert 8.0.6软件对表4数据分别进行多元线性、二项式回归拟合分析，分别得到A、B、C 与OD 值之间的回归模拟方程：OD=–0.858 28+0.006 02A+0.006 83B+0.036 31C（r=0.541 4）、OD=1.129 68+0.016 98A–0.015 84B–0.238 69C–0.000 07AB–0.000 62AC–0.000 59BC+0.000 02A2+0.000 18B2+0.017 80C2（r=0.852 7），结果表明二项式回归模型拟合度更好，可用于优化工艺。方差分析见表5。

表4 补肾强筋丸提取工艺响应面试验设计及结果

由表5 可知，模型F=6.43，P<0.01，表明模型具有极显著影响；F失拟＝0.26，P=0.914 6>0.05，表明模型失拟项不显著，可以用此模型进行分析和预测；因素B、B2差异有统计学意义（P<0.01），因素A 差异有统计学意义（P<0.05），而交互项均不显著；各因素的影响程度依次为B>A>C。

表5 补肾强筋丸提取工艺响应面方差分析结果

利用Design Expert 8.0.6 软件得到二次回归方程等高线及响应曲面图，从而确定最佳提取工艺参数，结果见图4～6。由图4～6 可知，B 的等高线密度均大于A和C，说明提取时间对成分提取量的影响最大，与方差分析结果一致，且指标成分随着3个因素的增加而有增加的趋势；最终确定最佳提取工艺为12倍水，浸泡60 min，提取120 min，提取2次。

图4 浸泡时间与溶剂量对OD值影响的响应面图

再按上述最佳工艺进行3批验证，测得OD 值分别为0.723 7、0.702 9、0.743 3，平均为0.723 3，RSD 为2.79%，同时与预测值0.745 7 相比偏差为3.0%，表明工艺稳定可行、重复性良好。结果见表6。

表6 补肾强筋丸提取工艺验证实验结果

3 讨论

补肾强筋方原剂型为汤剂，但因携带不便、患者依从性较差，故改为浓缩丸剂。全方以熟地黄、山茱萸为君药，当归、杜仲为臣药，续断、五加皮、白芍、茯苓、青皮为佐药，川牛膝为使药。其中，熟地黄的指标成分为地黄苷D[5]，现代药理研究表明，其具有提高免疫力、抗骨质疏松、抗炎等药理作用[14]；山茱萸活性成分为马钱苷和莫诺苷[5]，具有抑制软骨细胞凋亡、促进细胞生长、延缓骨关节炎等药理作用[15-16]；当归的活性成分为阿魏酸[5]，具有抗炎、镇痛、抗成骨细胞凋亡等药理作用[17]。这4个成分的药理作用与补肾强筋丸发挥补益肝肾、强筋健骨药效作用有关，同时充分考虑了处方君臣佐使的组方原则、药物各自的化学性质。臣药杜仲中的指标成分松脂醇二葡萄糖苷[5]在本研究中含量较低，可能与其胶丝有关[18]，为了减小误差，本研究未将松脂醇二葡萄糖苷作为指标成分。因此，本研究将地黄苷D、马钱苷、莫诺苷、阿魏酸作为指标成分。另外，浸膏得率也常作为中药复方提取工艺的评价指标[19]，故也将其纳入研究。

图5 浸泡时间与提取时间对OD值影响的响应面图

图6 提取时间与溶剂量对OD值影响的响应面图

本研究采用190～400 nm 全波长扫描，经查阅文献，4个成分的吸收波长差异较大[5]，本课题组在多次验证后发现，252 nm时各峰的吸收明显好于237 nm，且分离度良好，故最终确定203、252 nm 检测。在流动相方面，本研究考察了甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水，发现后者峰形更好，各成分分离效果更佳，最后综合考虑将后者作为流动相。

在权重系数的选择上，由于多指标评价采用打分制时存在一定主观性，故本研究对其进行归一化处理，以地黄苷D、马钱苷、莫诺苷、阿魏酸含量和浸膏得率的总评OD 值为评价指标，通过星点设计-效应面法来优化补肾强筋丸的提取工艺。结果表明，补肾强筋丸最佳提取工艺为12 倍水提取2次，每次浸泡60 min，提取120 min，所得OD 值与预测值相当，表明该方法提取效率较高、重复性较好、工艺稳定可行。