马齿苋黄酮提取工艺优化及体外抗氧化评价*

高珍琦，谢娜婷，陈丹丹，李珊颖，李增富,2

（1.三明学院 资源与化工学院，福建 三明 365004；2.药物植物开发利用福建省高校工程研究中心，福建 三明 365004）

马齿苋（Portulaca oleracea），又名马苋菜，石竹目、马齿苋科的一年生草本植物。肉质叶对生，扁平多汁，形状类似马齿，上下两面颜色区别明显，上面暗沉下面鲜艳；叶柄较其他部位略粗壮。我国马齿苋分布广泛，资源十分丰富[1]。大量研究表明，马齿苋含有黄酮类化合物、多糖、多酚等许多活性物质[2]，具有止痛、抗炎[3]、抗菌[4-7]和抗氧化[8,9]等多种功能[10-15]，是中国卫生部划定的101种药食同源野生植物之一，曾经被列入2008年北京奥运会的菜谱[1]。

目前马齿苋黄酮的提取方法有多种，常见的主要有溶剂提取法[16]、超声波辅助提取法[17]、微波辅助提取法[18]和酶解法等[19]。其中加热回流水提法提取率高、绿色环保。基于黄酮类化合物在水中有一定的溶解性[20]，本研究采用加热回流法[21]提取马齿苋中的总黄酮，以马齿苋总黄酮提取率为参考指标，优化提取的工艺条件并进行验证，探究马齿苋总黄酮的抗氧化能力，以期为马齿苋资源利用和功能性产品开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马齿苋（Portulaca oleracea），野生鲜品，购自福建三明市三元区。芦丁标准品，中国药品生物制品检定所。1,1-二苯基-2-苦基肼（DDPH），上海士锋生物科技有限公司。

亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FW80 型高速万能粉碎机，天津泰斯特；恒温水浴锅，江苏金坛；干燥箱，上海一恒；722s分光光度计，上海仪电。

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线的制备

称取芦丁对照品10 mg，用体积分数70%的乙醇溶解并定容到100 mL的容量瓶中，摇匀，得到0.1 mg/mL的标准溶液。

分别取标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL7组溶液置于10 mL容量瓶中，然后分别加入0.30 mL质量分数5%亚硝酸钠（NaNO2）溶液混匀，放置6 min后，加入0.30 mL质量分数10%硝酸铝Al(NO3)3溶液，混匀，放置6 min，最后加入4 mL质量分数4%NaOH溶液，充分混匀后使用70%的乙醇溶液定容至10 mL，室温放置15 min。以不加标准液的溶液为空白参比，在510 nm处测定每个浓度标准品溶液的吸光度，绘制芦丁标准曲线（图1），获得芦丁的标准曲线，回归方程为y=1.06x+0.0006，相关系数R2=0.9991表明存在良好的线性关系。

图1 芦丁标准曲线

1.3.2 马齿苋粉的制备

将新鲜马齿苋洗净，处理掉马齿苋根部并将其折成小段以利于烘干，置于烘箱中65 ℃干燥3～4 d，取出干燥的马齿苋利用高速粉碎机粉碎2～3次，最后过孔径60目筛成干粉常温密封储存备用。

1.3.3 单因素试验

准确称取2.0000 g马齿苋样品粉末，对料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，水浴温度60、70、80、90、100 ℃，乙醇浓度50%、60%、70%、80%、90%以及提取时间50、60、70、80、90 min进行优化，以每个单因素对马齿苋总黄酮提取率的影响来确定各因素的最适值。

1.3.4 正交试验及验证

根据单因素结果，设计四因素三水平的正交实验，对加热回流提取马齿苋总黄酮的工艺进行优化，并做验证实验。

1.3.5 黄酮提取液的抗氧化活性

根据参考文献[20]的方法进行测定，配制120 umol/LDPPH乙醇溶液。称取44 mgDPPH，无水乙醇定容至100 mL，0～5 ℃避光保存。取3 mL、120 umol/LDPPH溶液加入0.1 mL 不同浓度的马齿苋黄酮提取物溶液于试管，充分混合，黑暗条件下静置30 min，在 517 nm波长处测定其吸光度 Ai；以等体积无水乙醇代替马齿苋黄酮提取物溶液，在相同条件下测定其吸光度 A0；以等体积无水乙醇代替DPPH溶液在同条件下测定其吸光度At；以VC为阳性对照组，实验重复3次，按照公式⑴计算 DPPH自由基清除率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对总黄酮提取率的影响

设定加热回流马齿苋总黄酮提取的提取时间为60 min，乙醇浓度80%，水浴温度90 ℃，控制料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40加热回流提取2次，并分别通过对照空白组测定吸光度，测定分析计算总黄酮的提取率，结果见图2。

图2 料液比对马齿苋总黄酮提取率的影响

由图2可知，当料液比在1∶20～1∶40之间时，利用加热回流法得到马齿苋总黄酮提取率随着溶剂的量呈现上升的趋势，总黄酮提取率最高为5.01 mg/g，此时料液比为1∶30，之后马齿苋总黄酮的提取率开始呈现出稳定的趋势，由图可见随着总黄酮提取率的上升达到一个峰值后，样品表面的总黄酮浓度与提取液达到平衡状态，故其他条件相同的条件下料液比为1∶30最优。

2.1.2 水浴温度对总黄酮提取率的影响

设定其余外界条件相同，利用恒温水浴锅加热回流提取的料液比1∶30、提取时间60 min、乙醇浓度80%，控制其水浴温度60、70、80、90、100 ℃，加热回流提取2次，并分别通过对照空白组测定吸光度，测定分析计算总黄酮的提取率，结果见图3。

图3 水浴温度对马齿苋总黄酮提取率的影响

由图3可知，当水浴温度在60～100 ℃之间，利用加热回流法得到马齿苋总黄酮提取率随着温度的升高而增大，随后再升高温度提取率又降低。水浴温度为90 ℃时总黄酮提取率最高，为5.01 mg/g，说明温度的升高有助于溶剂渗透到组织细胞中，帮助提取率提高，当温度超过90 ℃的时候，温度太高导致黄酮类化合物结构受损而迅速降低了提取率，所以其他条件相同的条件下水浴温度为90 ℃为最优。

2.1.3 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

设定料液比1∶30，提取时间60 min，水浴温度90 ℃，控制乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%加热回流提取2次，并分别通过对照空白组测定吸光度，测定分析计算总黄酮的提取率，结果见图4。

图4 乙醇浓度对马齿苋总黄酮提取率的影响

由图4可知，当乙醇浓度为50～90%，利用加热回流法得到马齿苋总黄酮提取率随着乙醇浓度的升高而增大，乙醇浓度低于70%时，乙醇浓度升高总黄酮提取率随之增加，乙醇浓度为70%时总黄酮提取率最高，为5.23 mg/g，乙醇浓度大于70%之后总黄酮提取率反而开始降低，这说明乙醇浓度影响原料中总黄酮与溶剂中黄酮相互渗透而导致总黄酮提取率上升后下降，因此其他条件相同的情况下乙醇浓度为70%时有最优的黄酮提取率。

2.1.4 加热时间对总黄酮提取率的影响

设定其他条件相同，料液比1∶30，乙醇浓度70%，水浴温度90 ℃，加热时间分别为50、60、70、80、90 min，加热回流提取2次并分别通过对照空白组测定吸光度，测定分析计算总黄酮的提取率，结果见图5。

图5 加热时间对马齿苋总黄酮提取率的影响

由图5可知，加热时间50～90 min时，加热时间为70 min的时候有最高的总黄酮提取率为5.33 mg/g，利用加热回流得到总黄酮提取率随着加热时间增加迅速上升后略微降低并逐渐平稳，这是因为加热时间未到70 min的时候，溶剂还没有与组织细胞充分渗透，当时间超过70 min，样品中总黄酮与溶剂中总黄酮浓度基本趋于平衡，提取率达到稳定状态，所以其他条件相同的情况下选择加热时间为70 min为最佳。

2.2 正交试验及验证

在单因素试验中选择提取率最优条件的3个水平，采用4因素3水平正交试验（表1），考察料液比、水浴温度、乙醇浓度和加热时间对马齿苋总黄酮提取率的影响，获得一组总黄酮提取率最高的条件，结果见表2。

表1 因素水平表

表2 正交试验结果与分析

由表2可知，4个因素对马齿苋总黄酮提取率影响度从大到小是：水浴温度＞加热时间＞乙醇浓度＞料液比，最优工艺为A2B2C3D2，即料液比为1∶30、加热时间为70 min、乙醇浓度为80%、水浴温度90 ℃时，加热回流马齿苋总黄酮提取率最高。

采用优化工艺条件开展验证试验，得到的马齿苋总黄酮提取率为5.513 mg/g，符合正交试验得出的结果。

2.3 黄酮提取液的抗氧化活性评价

分别设置6组实验，考察马齿苋提取物和VC对DDPH自由基的清除率的影响，结果见图6。

图6 马齿苋总黄酮和Vc对DPPH清除率比较

由图6可知，马齿苋总黄酮提取液对DDPH自由基的清除效果略低于Vc，当溶液浓度升高，对DPPH的清除效果越强，马齿苋黄酮提取液具有较好的抗氧化活性。

3 结论

本研究通过单因素实验和正交实验得到最优马齿苋黄酮提取工艺为：料液比1∶30，加热时间70 min，乙醇浓度80%，水浴温度90 ℃，在此条件下马齿苋总黄酮提取率为5.513 mg/g。马齿苋总黄酮提取液对DPPH自由基具有较好的清除效果。