高效液相色谱法同时测定五味子中8种木脂素含量

李晓霞，刘忠英，孙严彤，刘 晓，汪戎锦

（吉林大学药学院药物分析教研室·吉林 长春·130021）

五味子（Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.）属木兰科的一种药用植物，多以其干燥成熟果实入药[1]。大量研究发现，五味子果实、茎、根中含有包括木脂素类、多糖类、挥发油和有机酸等在内的大量活性成分[2-5]，从而发挥中枢神经系统、心脑血管系统、消化系统等疾病的调节作用，具有较强的药用价值[6,7]。现代医学研究表明，五味子具有神经保护、心血管保护、肝脏保护、血糖和血脂调节、抗癌等药理作用，且常应用于神经系统和肾脏有关的疾病的临床治疗中[8-10]。

木脂素类化合物是五味子的主要活性成分[11]，约占五味子主要成分的8%[2]。其骨架结构是两个C6-C3单元通过位置8和8’之间的键连接而成的联苯环辛烯类化合物[4]。联苯环辛烯型木脂素具有许多羟基和甲氧基，它们之间可能形成氢键并与蛋白质结合，使蛋白质的生物学活性发生改变，从而发挥药理作用[12]。

目前，虽然对五味子木脂素的化学成分研究较多，却依然未将多种木脂素成分和总木脂素含量的分析方法纳入五味子质量标准的研究中。2020版《中国药典》中仅以五味子醇甲作为含量测定指标。因此，本研究采用高效液相色谱（HPLC）技术对五味子中8种木脂素成分进行测定，优化液相方法，并进行方法学考察。结合20批不同产地五味子木脂素含量的定量分析结果，为后续五味子及其炮制品的质量评价、质量标准的建立奠定基础。同时为其临床应用的安全性和有效性提供科学依据。

1 实验部分

1.1 药材、试剂及仪器

五味子醇甲（中国食品药品检定研究院，批号：110857-201714）；五味子醇乙（上海融禾医药科技有限公司，批号：180926）；当归酰基戈米辛H（上海融禾医药科技有限公司，批号：180927）；五味子酯甲（中国食品药品检定研究院，批号：111529-201706）；五味子酯乙（上海融禾医药科技有限公司，批号：181209）；五味子甲素（中国食品药品检定研究院，批号：110764-201714）；五味子乙素（中国食品药品检定研究院，批号：110765-201512）；五味子丙素（上海融禾医药科技有限公司，批号：181020）；甲醇（天津新通精细化工有限公司）；变色酸（天津市光复精细化工研究所）；硫酸（沈阳市派尔精细化工制品）；乙腈（默克股份公司）；磷酸（赛默飞科技有限公司）；Milli-Q Gradient A10超纯水系统（美国Millipore Inc）；紫外-可见分光光度计（美国Thermo，型号：G10S UV-Vis）；高效液相色谱仪（德国1260 Agilent Technologies）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。20批五味子的产地、批号等信息，详见表1。

表1 20批五味子信息表

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

1.2.1.1 供试品溶液制备

以序号为S1的吉林产五味子作为供试品进行条件优化及方法学考察。取本品粉末（过三号筛）约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密量取甲醇20mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率20 kHz）20分钟，取出，加甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得药材的供试品溶液。

1.2.1.2 对照品溶液制备

精密称取取五味子醇甲、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素对照品适量，加甲醇稀释成每1 mL含五味子醇甲4.55 mg、五味子醇乙3.36 mg、当归酰基戈米辛H 1.78 mg、五味子酯甲1.60 mg、五味子酯乙1.76 mg、五味子甲素3.00 mg、五味子乙素1.65 mg、五味子丙素1.60 mg的对照品溶液。

1.2.2 HPLC检测条件

选用Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱，以乙腈（A）-水（B）为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱条件见表2。流速1.0 mL/min；柱温30℃；检测波长：220 nm；进样量：10μL。

表2 梯度洗脱条件

1.2.3 方法学考察

通过专属性实验、线性考察、精密度考察、重复性考察、稳定性考察以及加样回收率考察对优化出的HPLC检测条件进行方法学考察，评价该方法的可行性。

1.2.4 不同产地五味子木脂素含量测定

精确称量表1所示的20批不同产地的五味子药材粉末，按照1.2.1进行样品制备，并采用1.2.2的条件进行HPLC检测，对20批不同产地五味子样本的8种木脂素进行定量分析。

2 实验结果

2.1 方法学考察结果

2.1.1 专属性试验

按1.2.1项下对照品溶液和供试品溶液的制备方法制备对照品溶液和供试品溶液。分别取甲醇为空白对照溶液、混合对照品为对照品溶液、供试品溶液，采用1.2.2中条件进行检测。

从图2中可以看出，五味子醇甲出峰时间在11.55 min附近；五味子醇乙出峰时间在15.36 min附近；当归酰基戈米辛H出峰时间在22.30 min附近；五味子酯甲出峰时间在31.86 min附近；五味子酯乙出峰时间在32.96 min附近；五味子甲素出峰时间在44.32 min附近；五味子乙素出峰时间在48.51 min附近；五味子丙素出峰时间在50.44 min附近。空白溶剂对各对照品及五味子样品成分峰未出现干扰，表明该方法专属性好，无杂峰干扰。

图2 五味子专属性考察

2.1.2 线性关系考察

精密吸取1.2.1项下各对照品储备液一定体积配制成混合对照品溶液，稀释得到系列浓度的混合对照品溶液。按1.2.2项下中的色谱条件进行测定，即得。以各对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。对照品溶液在一定浓度下均具有线性关系，其回归方程，详见表3。

表3 8种五味子木脂素对照品标准曲线

2.1.3 精密度考察

用1.2.1项下方法制备对照品溶液，测定条件同1.2.2中的色谱条件，连续进样6次，即得。结果表明，8种五味子木脂素的峰面积RSD值分别为0.52%、0.47%、0.49%、0.57%、0.52%、0.51%、0.47%、0.55%，均小于3.00%，表明该仪器精密度良好，符合定量分析要求。

2.1.4 重复性考察按1.2.1方法制备供试品溶液，测定条件同1.2.2中的色谱条件，连续进样6次，即得。结果表明，8种五味子木脂素的峰面积RSD值分别为0.56%、0.46%、0.45%、0.42%、0.57%、0.32%、0.25%、2.87%，均小于3.00%，表明该方法重复性良好，符合定量分析要求。

2.1.5 稳定性考察

按1.2.1方法制备供试品溶液，在制备后0、2、4、8、12、16、20、24 h时间点测定，测定条件同1.2.2中的色谱条件。

结果表明，8种五味子木脂素的峰面积RSD值分别为0.21%、0.30%、0.46%、0.83%、0.33%、0.84%、0.73%、2.73%，均小于3.00%，表明供五味子试品溶液在24 h内稳定性良好，符合定量分析要求。

2.1.6 重现性考察

按1.2.1方法制备同一批五味子供试品溶液6份，测定条件同1.2.2中的色谱条件，连续进样6次，即得。结果表明，8种五味子木脂素的含量的RSD值分别为0.53%、0.73%、2.09%、1.26%、0.28%、0.32%、0.27%、2.31%，均小于3.00%，表明该方法重现性良好，符合定量分析要求。

2.1.7 加样回收率考察

按1.2.1方法制备同一批五味子供试品溶液6份，测定条件同1.2.2中的色谱条件，连续进样6次，即得。

由表4可得，8种五味子木脂素的加样回收率在90～110%之间；RSD值均小于3.00%，表明该方法回收率良好，符合定量分析要求。

表4 加样回收率考察

2.2 20批不同产地五味子木脂素成分含量测定

将20批不同产地的五味子中8种木脂素的含量进行定量分析，结果见表5。

表5 20批五味子木脂素成分含量测定结果

3 讨论

通过测定波长、色谱柱、流动相种类、流速及柱温条件的优化从而筛选出五味子木脂素定量的最佳HPLC检测条件。

3.1 测定波长的选择

在DAD检测器扫描下，得到五味子3D谱图，由样品和混合对照品溶液的全扫图可得出五味子木脂素类化合物在220、250、280 nm处有最大吸收。五味子木脂素在220 nm下均具有很强的吸收，木脂素类成分出峰数目多，响应值高，故选择测定波长为220nm。

3.2 色谱柱的选择

分别选用Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱、Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱和Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，比较采用不同色谱柱时五味子木脂素的分离效果。通过分析样品峰利用不同色谱柱进行检测时的分离度、峰形等指标，得出Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱分离度低、峰形差、且基线不稳。采用Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱检测时，五味子酯甲、五味子酯乙的分离度低。Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱检测时，样品峰的分离度及峰形较好，色谱峰分布均匀。最终选用Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱进行基于高效液相色谱法的木脂素定量研究。

3.3 流动相种类的选择

改变流动相种类，比较选择不同流动相时，五味子木脂素的分离效果，从而选择最佳的流动相种类。通过分析样品峰在不同条件下的分离度、峰形等指标，得出乙腈（A）-0.5%磷酸水（B）、乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）为流动相时，基线不平稳。乙腈（A）-水（B）为流动相时，五味子醇甲等待测成分具有较高分离度、峰形较好且基线平稳。最终选用乙腈（A）-水（B）作为流动相。

3.4 流速的选择

改变流动相流速，比较不同流速时，色谱图中五味子木脂素的分离效果，从而选择最优流速。结果表明，当流速为0.8 mL/min时，4号峰分离度较低。流速为1.2 mL/min时，6号峰和7号峰的峰形不好，而流速为1.0 mL/min时各峰分离度高、峰形好，综合分析样品峰在不同条件的分离度、峰形，最终选择流速为1.0 mL/min。

3.5 柱温的选择

改变色谱柱温度，比较不同柱温时，色谱图中五味子木脂素的分离效果，从而选择最优检测柱温。结果表明，当柱温为35℃时，指标峰分离度较差；柱温为25℃时，1号峰分离度较低；柱温为30℃时，各指标峰的分离度及理论塔板数达到标准，综合分析样品峰在不同条件的分离度及峰形，最终选择在柱温为30℃条件下进行检测。

4 结论

本研究建立了一种基于HPLC技术同时测定五味子中8种木脂素成分含量的检测方法。通过实验条件优化，最终确定选用Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱，以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，检测波长为220nm的含量测定方法。按2020年版《中国药典》的有关规定，进行一系列方法学考察，包括专属性、线性范围、精密度、准确度、稳定性和加样回收率考察。并采用此方法对20批不同产地的五味子中8种木脂素进行定量分析。结果表明，本文所建立的五味子木脂素成分含量测定方法灵敏、专属性强、精密度高、重复性好，加样回收率在93.38%～103.87%（n=6）范围，且RSD值均小于3.00%。本方法能够同时检测8种木脂素含量，色谱峰的分离度较高，具有较好的峰形，且操作简便易行。因此，可将此方法作为该药材的指标评价方法，并可为今后五味子药材的质量评价提供参考标准及科学依据。

综上，本研究建立的五味子指纹图谱结合木脂素定量分析方法，能够客观地反映五味子内在质量的一致性与真实性，为制定五味子这一传统中药的质量标准与品质评价模式提供重要的理论依据。