基于网络药理学探讨白芍治疗系统性红斑狼疮的分子机制

郭子琳，夏聪敏，唐晓颇✉

（1.中国中医科学院广安门医院，北京 100053；2.北京中医药大学，北京 100029）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种慢性自身免疫病，患者体内产生异常的自身抗体、补体和免疫复合物［1-2］，常攻击多器官、多系统［3］。SLE 在我国患病率达30～70/10 万［4］，其发病机制尚无定论，临床症状复杂多样，病势迁延，威胁着众多育龄期女性［5-6］。糖皮质激素、免疫抑制剂是临床常用药［7］，但由于远期疗效及安全性欠佳、价格昂贵等问题，本病治疗始终存在瓶颈［8］。

中医对SLE 的认识历史悠久，《内经》云：“风雨寒热不得虚，邪不能独伤人。此必因虚邪之风……乃客其形”，点明其发病核心在于本虚；《金匮要略》专篇首次以“阴阳毒”命名，认为病机属虚实夹杂，邪盛正虚贯穿始终［9］。近年来，中医药治疗SLE 崭露头角，在增效减毒、调节免疫、控制疾病活动、促进激素撤减等方面优势突出［10］。白芍作为风湿免疫科常用中药，临床疗效确切［11-12］，不仅能明显改善SLE 患者实验室指标，降低血清免疫因子水平［13-14］，还能控制疾病活动，激活低表达免疫细胞［15］。但其发挥作用的具体物质基础和分子机制尚待阐明。

网络药理学是在疾病－靶点－药物的多层次网络基础上研究起效机制，与中医整体观念相呼应，应用十分广泛［16-17］。本研究借助此方法，挖掘白芍治疗SLE的深层机制，探讨其科学内涵。

1 材料与方法

1.1 白芍活性成分筛选和靶点预测

基于TCMSP平台［18］（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）检索并筛选出口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug likeness，DL）≥0.18［19］的白芍活性成分，结合文献补充完善筛选结果。从PubChem［20］（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库查找对应的标准化 SMILES 格式导入SwissTargetPrediction［21］（http：//www.swisstargetprediction.ch/）平台，得到活性成分对应的靶标，与TCMSP所预测靶标汇总去重后，利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）数据库进行基因标准化处理。

1.2 白芍“活性成分－靶点”网络构建

利用Cytoscape3.7.2［22］软件将上述结果构建为“白芍－活性成分－潜在靶标”网络图，其中药物、活性成分、潜在靶标以“节点”（node）表示，三者关联情况由“边”（edge）呈现。

1.3 疾病相关靶点确定

以“systemic lupus erythematosus”为关键词，从TTD［23］、OMIM［24］、GeneCards［25］、DrugBank［26］、CTD［27］等数据库检索、筛选疾病靶点，去重后导入Uniprot 数据库实现基因标准化，获得SLE 相关靶点，再通过Venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）平台提取出白芍和SLE的交集靶点。

1.4 蛋白互作网络构建及关键靶点筛选

将白芍与SLE 相关靶点分别导入BisoGenet 插件中，得到各自的蛋白互作（protein protein interaction，PPI）网络，利用Merge 功能获取二者交集部分，结合拓扑分析插件CytoNCA［28］及相关研究文献，将交集网络中各节点的属性值逐一进行分析。算出连接度的中位数并提取所有大于其2 倍值的节点，得到“Hit hubs”网络。接着提取所有大于连接度（degree centrality，DC）2 倍中位数的节点，以及所有大于紧密度（closeness centrality，CC）、介度（betweenness centrality，BC）、特征向量（eigenvector centrality，EC）、网络中心性（network centrality，NC）和局部边连通性（local average connectivity，LAC）中位数的节点，作为核心靶点。

1.5 通路富集分析

数量庞大的基因、蛋白生物功能注释信息都可通过检索DAVID 数据库［29］（https：//david.ncifcrf.gov/）获得。将白芍与SLE 的共同靶点录入DAVID 数据库，勾选GO 插件中的生物过程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）选项，以及Pathway插件中的KEGG 选项，完成富集分析。提取GO 中P值＜0.1、KEGG 中P值＜0.05 的结果，经微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）平台绘制气泡图，P值展示为节点颜色变化，气泡大小表示基因数。

2 结果

2.1 白芍活性成分筛选与ADME分析

TCMSP 数据库共检索出白芍相关成分85 个，经OB 和DL 筛选出13 个，查询靶点及相关文献后剔除4个，最终纳入有效活性成分9个，见表1。

表1 白芍活性成分表

2.2 “活性成分－靶点”网络构建

利用靶点预测技术得到80 个相关靶点，经Cytoscap 3.7.2绘制白芍“活性成分－靶点”网络，网络中共存在90 个节点（包含80 个靶点和9 个活性成分）和138 条关系，见图1。节点面积越大表示度值越大，生物学功能和重要性相应提升。

图1 白芍“活性成分－靶点”网络图

2.3 疾病相关靶点获取

检索TTD、OMIM、GeneCards、DrugBank、CTD 数据库，分别得到疾病靶点133、545、29、67、100 个，汇总去重后共计793 个。绘制Venn 图，见图2，可视化展示二者交集，可见白芍治疗SLE的潜在靶点有20个。

图2 白芍治疗SLE的潜在靶点Venn图

2.4 PPI网络构建和关键靶点分析

利用BisoGenet插件分别构建白芍和SLE的PPI网络，发现白芍可通过2 989 个靶点发挥作用，其间相互关系达70 169 条；SLE 潜在靶点有7 476 个，关联达176 712条，二者交集网络见图3。

图3 白芍与系统性红斑狼疮的PPI交集网络

为进一步扩充节点连接信息、提升传递效率、明确关键作用靶点，对PPI网络进行了2次拓扑属性筛选，得到关键靶点278个，筛选策略和最终结果见图4～5。

图4 白芍干预SLE关键节点的筛选策略

2.5 白芍“活性成分－靶点－疾病”生物学功能和通路分析

运用DAVID 数据库进行富集分析，并根据所涉及的信号通路推测潜在作用机制。取GO 富集BP 模块中P值＜0.1、KEGG 中P值＜0.05 的结果绘制气泡图，结果见图6。其中，横轴为通路基因在总体中所占的比率，纵轴为富集名称，气泡颜色由红到绿表示-log10（P）值依次减小，气泡大小代表该通路所包含的基因数。

图6 白芍治疗系统性红斑狼疮作用靶点富集分析气泡图

图5 白芍核心靶点PPI网络

GO 富集得到127 个结果，其中BP 94 个，CC 6 个，MF 27 个，KEGG 富集得到34 条通路。分析结果提示：白芍调控SLE主要涉及炎症反应、转录因子调控、细胞因子合成、氧化应激抵抗、激素药物反应和细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程，以及TNF、花生四烯酸代谢、Nod 样受体（NOD－like receptor signaling pathway，NLR）、Toll 样受体（toll－like receptor signaling pathway，TLR）、癌症、细菌感染、激素合成等多条信号通路。

2.6 “成分－靶点－通路”网络构建

根据KEGG 及其映射的显著差异基因，构建“成分－靶点－通路”网络，包括22条信号通路、17个基因靶点、7个成分和119条关系，见图7。据图推测，白芍干预SLE 的关键靶基因可能为Degree 值较大的TNF、CASP3、IL6、CASP8、TGFB1、NOS2。

图7 “成分－靶点－通路”网络图

3 讨论

SLE 可归属“痹病”“阴阳毒”“红蝴蝶疮”等范畴［30］。临床医家多认为SLE 证属本虚标实，毒蕴血瘀是病理关键，故以扶正祛邪为治疗大法［31］。白芍是毛茛科植物芍药的干燥根，性微寒，味苦而酸，入肝、脾经，可养血柔肝止痛、敛阴平抑肝阳，是风湿免疫病组方常用中药。药理学研究证实［32］，白芍具有明显的抗炎、镇痛、保肝、抗氧化等功效。临床从气、血、水辨治SLE，取白芍滋阴利水、扶脾胃、解药毒之效，疗效确切［33］。网络药理学与中医整体观念高度重合，故笔者选用这一方法探索白芍治疗SLE的起效机制。

本研究共筛选出芍药苷、儿茶素、山柰酚在内的白芍核心成分9 个，涉及60 个靶点，富集结果分布在NF－κB、TNF、Toll 样受体、Nod 样受体及花生四烯酸代谢、癌症、雌激素等信号通路，充分展现出了白芍多成分、多靶点、多通路治疗SLE的特点。

研究显示［34-35］，芍药苷可通过NF－κB和ERK通路相关机制阻碍TNF－α 诱导趋化因子的产生和白细胞迁移，从而发挥体外抗炎作用；还可抑制免疫调节因子及组织蛋白mRNA表达、调节细胞免疫以治疗疾病［36］；同时能促进骨髓造血以增强免疫功能［37］，与扶正固本的中医思想不谋而合。目前广泛应用的白芍总苷复合制剂含40%以上芍药苷成分，具有抗炎和双向免疫调节等作用［38-39］，且疗效温和、适用性强、安全性佳，已成为临床优选用药方案［40-41］。儿茶素凭借对Th17/Treg特异性转录因子ROR－γt mRNA/Foxp3 mRNA 表达的双重调节作用，使机体恢复免疫平衡状态［42］。山柰酚可使免疫抑制细胞Treg 活化，实现免疫耐受和免疫稳态［43］。

根据富集结果推测白芍治疗SLE 的起效机制，可概括为以下两种：

（1）直接调控TLRs、NLRs、NF－κB、TNF 等信号通路。TLRs通路以NF－κB活化和免疫应答基因转录为主，TLR 属于模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR），可特异性识别病原体并启动炎症信号通路［44］。研究发现［45-46］，B 细胞中固有的TLR7 缺失可抑制自身免疫；相反TLR9缺失则促使免疫复合物（IC）沉积，加剧系统性炎症；TLR9激活是SLE常见并发症狼疮肾炎发生的重要原因［47］。多效应细胞因子TNF－α由T 细胞和单核－巨噬细胞分泌，通过影响机体免疫应答参与SLE 发病过程［48］；还能加剧组织相容性抗原之间的免疫反应，导致疾病进展［49］。NLR 家族同属天然免疫PRR，在病原和损伤相关分子模式的识别中举足轻重［50］。家族中的NOD 蛋白和配体结合后，可通过下游受体蛋白的相互作用激活NF－κB 通路，诱导促炎细胞因子及趋化因子转录上调，介导炎症反应［51-52］，还能催化凋亡相关细胞因子的表达以及参与1 型糖尿病等适应性免疫反应的启动［53］。白芍或许能直接调控上述通路，从而改善SLE。

（2）间接调控信号通路和多系统代谢靶点。花生四烯酸通过COX 酶代谢生成前列腺素，引起疼痛、血管扩张（肿胀和红肿）和发热等症状［54-55］；5－LO 酶与激活蛋白结合推动花生四烯酸转化形成白三烯，促使中性粒细胞趋化［56］。雌激素促炎和抗炎双向作用分别由受体ER－α、β介导，其表达量分别同SLE患者病情活动度呈正、负相关［57］。雌激素可选择性激活或抑制miR－145、miR－125a和miR－146a等SLE相关miRNA，影响基因表达［58］。白芍可能通过干预上述通路，间接发挥对SLE的治疗作用。

另外GO 富集分析网络覆盖细胞色素P450 酶代谢、细胞凋亡、神经营养、脂肪细胞因子和卵巢类固醇合成、癌症、肌萎缩侧索硬化症、2 型糖尿病等信号通路，说明白芍可调控多个系统和多种代谢途径靶点，从而影响自身免疫状态、干预SLE病理过程。

4 结语

本研究基于网络药理学技术，拟深挖白芍物质基础和对SLE 的起效机制，研究结果与已知文献报道吻合，验证了靶点预测技术的准确性，也为中医新药研发、临床应用及后续研究提供了新的依据。但囿于这一手段的局限性和机体反应的非单一性，仅就白芍的药理成分进行预测探讨，具体机制仍需进一步挖掘和验证。