60Co-γ辐射对元胡品质及根际菌群的作用

付馨雨 黄怡红 吴燕飞 万奕彬 厉永强 马美兰 袁小凤，4

1.浙江中医药大学生命科学学院 杭州 310053 2.东阳市种植业技术推广中心 3.东阳市农业科学研究所

4.浙江中医药大学中医药科学院

元胡（Corydalis turtschaninovii，C.turtschaninovii）为罂粟科紫堇属多年生草本植物，其干燥块茎亦名延胡索，具有活血、行气、止痛等功效[1]，含有延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丙素（原阿片碱）等生物碱类成分[2]。研究表明，延胡索镇痛、镇静、催眠等作用显著，同时对冠心病、胃溃疡、心律失常等也有良好的治疗效果[3]。元胡作为国内许多著名中成药的主要原料，市场需求量日益增加，引种栽培以及品种选育对元胡培育的可持续发展具有重要意义。

近年来已有利用60Co-γ射线对作物进行辐射育种的研究[4]，包括睡莲[5]、石斛[6]、甘蔗[7]、大蒜[8]等，但针对药用植物的研究还不多见。辐射诱变时，选择合适的剂量至关重要。从目前的研究来看，不同作物之间辐射诱变的剂量差别较大。豇豆（Vigna mungo）的最佳诱变育种剂量为600 Gy[9]，而辐射剂量超过200 Gy会增加路易斯安那鸢尾（Louisiana irises）种子的致死率[10]。迄今为止，有关元胡的诱变育种工作还鲜见报道。

本研究选用不同剂量的60Co-γ射线辐射元胡种子，一个生长周期后收获，测定辐射后元胡的产量和有效成分的含量，同时进一步探讨辐射育种对元胡根际土壤微生物多样性和菌种群落结构产生的影响[11]，筛选最佳辐射剂量，以期探索元胡高效栽培技术，为元胡的规范化种植提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验方法与样品采集 实验基地位于元胡道地产区东阳塘西实验基地，土壤类型均一，为砂壤土，供试品种为浙胡1号。整个实验分为7组：0（无辐射组）、40、60、80、100、120、140 Gy60Co-γ射线辐射组。 利用“五点采样法”采集不同组元胡根际土约500 g，过20目筛后装入密封袋中，-20℃冰箱保存备用。同时收集元胡块茎，以自来水洗净，晾干后称鲜重，60℃烘干至恒重，打粉备用，计算变异膨大率，变异膨大率（%）=（各组元胡粒径-无辐射组粒径）/无辐射组粒径×100%。实验每组均重复3次。

1.2 元胡块茎药效成分检测 利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）[12-13]检测元胡块茎中巴马汀、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、延胡索甲素以及总生物碱含量。色谱条件：色谱柱：Poroshell120EC－C18（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；柱温：30 ℃；流动相：0.1%乙酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～20 min，20%～25%A；20～55 min，25%～45%A；55～65 min，45%～55%A）；流速：1 mL·min-1；检测波长：280 nm；进样量：10 μL。

1.3 土壤总基因组DNA提取及聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增 利用试剂盒提取土壤总基因组DNA，具体方法参照OMEGA试剂盒的使用说明书进行。利用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒，对基因组DNA进行精确定量。PCR引物已经融合了Miseq测序平台的V3-V4通用引物。第一轮PCR：94℃预变性3 min；前5个循环，94℃变性30 s，45℃退火20 s，65 ℃延伸30 s； 后20个循环，94 ℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，最后72℃延伸5 min。第二轮扩增过程引入Illumina桥式PCR兼容引物，95℃预变性30 s，共5个循环，95℃变性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，最后72℃延伸5 min。 DNA的纯化回收参照文献[14]的方法，选用0.6倍的磁珠（AgencourtAM Pure XP试剂盒）处理，回收产物以Qubit 2.0试剂盒进行定量，根据测得DNA浓度，将样品按照1∶1等量混合均匀，每个样品DNA量为10 ng，由上海生工生物工程有限公司进行Miseq高通量测序。

1.4 统计学分析 检测细菌在总基因水平上的百分比及操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）、基于丰度的覆盖率估计值（abundance-based coverage estimator，ACE）、Chao1和Shannon等指数分析菌群多样性。应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，所有计量资料均以±s表示，多个均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 辐射剂量对元胡产量与品质的影响 收集各组新鲜的元胡块茎，结果显示，60Co-γ辐射后对元胡块茎的大小产生了明显的改变。见图1。无辐射组元胡块茎形状较为规则，粒茎均匀，直径1 cm左右；而各辐射组元胡块茎形状呈现不规则膨大的较多，粒茎大小不均匀。结合多项数据来看，无辐射组鲜重、干重和粒径均最低，随着辐射剂量的增加，元胡粒茎鲜重、干重和粒径呈现逐渐增加的趋势，在辐射量达到140 Gy时，鲜重、粒径以及膨大率均达到最大，表明辐射剂量对元胡的块茎膨大有明显的促进作用。见图2。

图1 不同60Co-γ辐射剂量组新鲜元胡Fig.1 Fresh C.turtschaninovii with different60Co-γ radiation dosage groups

图2 不同60Co-γ辐射剂量对元胡的影响Fig.2 The influence of different60Co-γ radiation dosages on C.turtschaninovii

运用HPLC检测各辐射组元胡中的巴马汀、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、延胡索甲素以及总生物碱含量。药典规定，干燥品中延胡索乙素含量不得低于0.050%，各组延胡索乙素含量均超过国标，60、80 Gy辐射组中最低，140 Gy辐射组中最高。与无辐射组比较，各辐射组脱氢紫堇碱含量差异具有统计学意义（P＜0.05）；除40、80 Gy辐射组外，其余各辐射组的延胡索甲素含量差异具有统计学意义（P＜0.05），但巴马汀含量差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。表明辐射对元胡的有效成分含量产生了一定的影响，然而其有效成分含量并未随着辐射剂量的增加而增加。

图3 不同60Co-γ辐射剂量组元胡块茎药效成分含量Fig.3 The contents of the effective components in the tubers of different60Co-γ radiation dosages

2.2 辐射剂量对根际细菌多样性的影响 利用Miseq高通量测序[15]检测各组根际土细菌多样性差异。见表1。与无辐射组比较，辐射组Shannon指数和Chao1均上升（P＜0.05），表明辐射提升了根际细菌的多样性。其中，60、80 Gy辐射组的Shannon指数皆高，与其他剂量的辐射组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。60Co-γ辐射会改变土壤细菌多样性，但其变化趋势并不是简单地与辐射剂量成正比，在80 Gy时细菌多样性达到最大。

表1 不同60Co-γ辐射剂量组根际土细菌多样性指数Tab.1 Bacterial diversity index of rhizosphere soil in different60Co-γ radiation dosage groups （±s）

表1 不同60Co-γ辐射剂量组根际土细菌多样性指数Tab.1 Bacterial diversity index of rhizosphere soil in different60Co-γ radiation dosage groups （±s）

注：OTU、ACE、Chao1指数是根际土壤菌群丰度的评估指标，Shannon指数是根际土壤菌群多样性的评估指标。不同字母表示组间差异有统计学意义（P＜0.05），相同字母表示组间差异无统计学意义（P＞0.05）。Note:OTU， ACE and Chao1 indexes are the evaluation indexes of the abundance of rhizosphere soil flora， and Shannon index is the evaluation indexes of rhizosphere soil flora diversity.Different letters with different labels in different groups indicate significant differences between treatments（P＜0.05）， and different letters indicate no significant differences between treatments（P＞0.05）.

组别 序列 OTU Shannon指数 ACE指数 Chao1指数 覆盖范围无辐射组 35 537.33±1 781.17a 5 915.33±329.51b 6.91±0.01c 24 871.15±3 939.23a 15 679.87±1 768.15b 0.90±0.01a 40 Gy 辐射组 33 747.00±2 751.12a 6 167.67±36.02ab 6.96±0.01c 28 780.65±2 732.54a 18 147.28±1 448.22a 0.88±0.01ab 60 Gy 辐射组 31 823.33±40.38a 6 552.00±254.62ab 7.31±0.03a 27 911.89±6 065.34a 17 782.73±2 727.05a 0.87±0.01ab 80 Gy 辐射组 30 921.67±1 498.99a 6 733.33±422.82a 7.30±0.08a 32 161.07±7 561.52a 19 417.27±3 427.41a 0.86±0.02b 100 Gy辐射组 30 864.67±7 403.51a 6 100.33±806.57ab 7.13±0.03b 27 251.51±2 691.46a 16 802.32±1 756.51a 0.87±0.02ab 120 Gy辐射组 32 975.00±676.58a 6 012.00±190.65b 6.91±0.06c 31 292.68±2 295.03a 18 161.97±1 046.73a 0.88±0.01ab 140 Gy 辐射组 34 551.67±3 504.25a 6 563.67±342.11ab 7.17±0.03b 28 899.01±2 729.91a 18 023.98±1 185.55a 0.88±0.01ab

2.3 辐射剂量对根际细菌群落结构的影响 Miseq高通量测序结果见图4。在所有采集的土壤样品中共检测到28门、151科、393属和超过693种的细菌。元胡根际的细菌主要包括变形菌（Proteobacteria，41%～46%）、酸杆菌（Acidobacteria，15%～18%）、放线菌 （Actinobacteria，10%～13%）、 拟杆菌 （Bacteroidetes，3%～5%）、 厚壁菌（Firmicutes，4%～5%）、出芽单胞菌（Gemmatimonadetes，4%～5%）、浮霉菌（Planctomycetes，2.5%～4.0%）、疣微菌（Verrucomicrobia，2%～4%）及 绿 弯 菌 （Chloroflexi，1.5%～2.5%）。与无辐射组比较，40 Gy辐射组仅拟杆菌有差异，140 Gy组仅厚壁菌有差异，说明低剂量与高剂量辐射对根际菌群结构产生的影响均较少；而60、100和120 Gy辐射组各有三种菌有差异，80 Gy组的变形菌、酸杆菌、拟杆菌、厚壁菌、出芽单胞菌及绿弯菌6类菌均有差异。这表明中剂量尤其是80 Gy辐射，对元胡根际细菌群落结构会产生较大影响。对不同辐射组中的同一类菌进行两两比较发现，组间差异并不随辐射剂量的升高而呈现规律变化。

图4 不同60Co-γ辐射剂量组根际土壤中细菌群落门水平结构组分Fig.4 The horizontal structural components of bacterial community in rhizosphere soil of different60Co-γ radiation dosage groups

在属的水平上，检测到Curvibacter、Thiomonas、Pedomicrobium、Pseudochrobactrum、Nubsella、Azospira、Thermodesulfovibrio、Gp25共8属细菌在各辐射组中均存在，但不存在于无辐射组中，其中前5种均属于变形菌，其余分属拟杆菌、厚壁菌和酸杆菌。这些细菌数量虽然不多，但是其对根际细菌多样性与根际微生态产生的影响值得探究。综合门类水平与属类水平细菌结构，发现60Co-γ辐射后会对根际土中的细菌种类产生影响，不同根际菌群的数量趋于均匀，这些改变导致了辐射组细菌多样性的升高。

对聚类后各样品中门水平丰度作热图，可反映出门水平上各样品菌群结构差异。见图5。60 Gy辐射组根际菌群被单独划为一类，说明该组根际菌群结构与其他组明显不同。比较各组的细菌组成发现，60 Gy辐射 组 根 际 菌 群 中 Acidobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Verrucomicrobia、Chloroflexi与其他剂量辐射组差异均有统计学意义（P＜0.05），是造成根际菌群结构不同的主要原因。

图5 不同60Co-γ辐射剂量组根际土细菌门水平热图Fig.5 Heat map of rhizosphere soil bacteria in different60Co-γ radiation dosage groups at phylum level

3 讨论

本研究使用不同辐射剂量，对元胡新鲜种子进行60Co-γ辐射敏感性试验，研究侧重于对存活元胡的生长情况以及根际微生物组成的分析，以期为开展元胡育种打下基础。一般来说，随着辐射剂量的增加，突变频率也会相应提高，但过高的辐射剂量会干扰生物体正常代谢，增加畸变率[16-17]。结合前期研究发现，随辐射剂量的增加，元胡的出苗率下降，生育期的块茎数减少，140 Gy时出苗率仅20.8%[18]，收获期元胡的鲜重、干重、粒径的大小跟辐射剂量成正比，证实60Co-γ辐射会增加元胡的产量，与Hanafy等[19]对葫芦巴的研究和张雨欣等[20]对白热斯的研究结果相似。由此可见，利用60Co-γ辐射块茎进行元胡的诱变育种可行，然而高剂量辐射会引起变异，导致种茎大小不一，前期研究中高剂量辐射组元胡出苗率低，也说明辐射剂量并非越大越好。

辐射会对种子的生长、发育产生影响，植物生长状态的变化同时会导致土壤营养成分的变化[21]，而这些变化都会间接影响根际微生物的数量[22-23]。反过来，微生物多样性的增加对植物生长和发育也会产生影响，Raynaud等[24]发现微生物多样性与植物生物量存在正相关关系。一般来说，根际菌群微生物多样性越高，对植物生长影响越大[25]。本研究结果表明，辐射育种对根际细菌群落结构产生了较大影响，与何永美等[26]的研究结果相似，他们通过紫外线照射不同生长时期的水稻，发现紫外线照射能显著影响根际微生物数量。值得注意的是，60、80 Gy辐射组根际土细菌多样性水平均比其他辐射组高，说明60、80 Gy辐射组根际细菌的多样性较佳。因此推测在60、80 Gy60Co-γ辐射剂量下，元胡生物量增加，而且其生物活动所导致土壤养分的变化有利于根际微生物数量的增加。

综上所述，结合各项参数指标，拟选用60～80 Gy作为元胡种子辐射育种的最佳剂量。当然，其育种的实际效果还有待进一步的田间选育。