不同消毒处理对葡萄外植体成活率的影响

闫百玲，闫德明

（1.甘肃省农业建设项目管理站，甘肃 兰州 730046；2.甘肃建筑职业技术学院，甘肃 兰州 730050）

葡萄是世界第二大水果，有着悠久的栽培历史[1]。我国西北地区具有栽培葡萄得天独厚的自然条件[2]，为解决传统育苗周期长等缺点，利用植物组织培养进行外植体系的建立迫在眉睫。近年来，国内外对葡萄组织培养的研究越来越多，其中利用“组培法”提高苗木繁殖系数的研究备受重视[3-4]。葡萄扦插技术不能获得大量的脱毒苗，传统的育种技术很难获得抗病葡萄品种，组织培养技术对葡萄无病毒株系建立、转基因葡萄育种研究提供了技术支持[5]。仅仅依靠扦插繁殖和茎尖培养难以满足生产需要，单芽茎段繁殖为葡萄苗木的大量繁殖提供了一个新的有效的方法和途径[6-7]。

1 材料与方法

1.1 材料预处理和消毒

选取4 年生葡萄植株，剪取春季萌发的新梢，选择长势基本一致的红地球和阳光玫瑰枝条，所剪取的枝条长势旺盛，枝条芽点饱满，用2 封报纸包好，注明品种后迅速拿回实验室，用灭过菌的剪刀将新梢剪成5～6 cm 带腋芽的单芽茎段，在剪的过程中剪除叶片留下叶柄，然后将红地球和阳光玫瑰2 个品种单芽茎段放在已消毒的烧杯内，并用纱布包扎好，注明品种名，流水冲洗3 h，倒完积水后转入超净工作台，用火焰灭菌的剪刀剪去病虫枝、伤残枝、小叶片后，将其剪成短于广口瓶的枝条，放入经干燥灭菌的广口瓶中。

倒入无菌水冲洗和浸泡1 次，倒出无菌水加入70%酒精，浸泡并摇动10 s；迅速倒出酒精加2%次氯酸钠溶液浸泡8 min，并摇动；倒出次氯酸钠并用0.1%升汞浸泡，3 个处理各摇动3 min、5 min、7 min倒出，用无菌水冲洗5 次。最后将消毒的枝条取出，放入灭过菌铺有滤纸的培养皿中吸干水，每个处理只用1 个培养皿，并再用无菌剪刀剪除受伤断面，最后留2 cm 左右，注意枝条的灭菌消毒过程必须在无菌条件下进行操作。

1.2 消毒处理方法

处理A：70%酒精10 s+2%次氯酸钠8 min+0.1%升汞3 min；处理B：70%酒精10 s+2%次氯酸钠8 min+0.1%升汞5 min；处理C：70%酒精10 s+2%次氯酸钠8 min+0.1%升汞7 min。

1.3 外植体转接

消毒完毕后，在无菌条件下用剪刀将枝条剪成2.0 cm 左右的单芽茎段，下段梢长、上段较短，但剪口距芽至少0.5 cm。再用镊子将其竖直插入改良B5培养基中。插完后在火焰上旋转数秒，立即塞严棉塞和包头纸，并在瓶体外写明品种名称、编号，然后将其放置于环境温度25±3 ℃、相对湿度70%左右、每日光照2 000 lx 以上、12～18 h 的培养室中进行初代培养。

1.4 测定

1.4.1 测定时间 接种4 d 后开始观测污染、萌芽、生根以及株高情况，污染率每天观测1 次，共4 次。接种5 d 后统计发芽率、生根率、株高，并每隔3 天观测1 次，共4 次。

1.4.2 污染率测定 统计污染瓶数。

1.4.3 发芽率测定 记录发芽个数。

1.4.4 生根率测定 统计生根数量。

1.4.5 累计根长测定 对接种10 d 后的12 d 内累计根长进行测定（每隔3 天观测1 次，共4 次）

统计根长并计算累计根长。

2 结果与分析

试验消毒处理中，处理B、处理C 消毒的外植体，在无菌水清洗过程中有较多的幼嫩组织和残渣随无菌水流出，颜色发黄；而处理A 的冲洗水较澄清，初步说明高浓度的、长时间的消毒处理已杀死部分幼嫩组织；2 个品种的处理C 外植体幼嫩茎处略发黑。

根据日常的观察和测量所知，刚刚接种后的前几天内植株生长很弱，尤其是7 min 升汞处理下的外植体，叶片发育不全、畸形生长，叶缘发黑，明显受到升汞等消毒试剂的毒害。试管苗的大量生根从接种10 d 后开始，并且主根如果沿顺时针方向延伸，则须根沿逆时针方向延伸，根系以最大限度的利用空间，当根系长到大概1.5 mm时，开始长须根，并且须根成对排列。供试试管苗的根系到接种后25 d 左右，根粗达到最大值，此后基本上不再增粗，以大量长须根为主，并且根据统计结果显示，最粗主根达到3 mm，是红地球品种的处理B。

试管苗的生长表现也不一致。有些试管苗已发芽，但始终没有生根，此类不生根的试管苗随着培养时间的延长叶片发黄失绿，株高生长到一定程度就不再生长，玻璃化现象多发生在不生根的试管苗内。不生根的试管苗生长与外植体的大小、粗细有关。越粗、越长的外植体株高越高。由此可以判断，外植体在未生根以前是利用外植体内储藏的营养供芽生长，等到材料内储藏的营养消耗殆尽，植株停止生长，并渐渐出现玻璃化现象。

已发芽的生根试管苗和不生根试管苗，叶片从叶缘叶尖处发黄，表现出缺少微量Mn 等元素症状，但是此后的培养使已生根的试管苗逐步恢复绿色，叶片逐渐变为正常叶片，而未生根的试管苗，叶片叶缘叶尖黄化越来越严重。由此可知，所采集的外植体材料本身就缺少Mn 等微量元素，而已生根的植株可以通过根系吸收培养基中的微量元素以缓解叶片叶缘叶尖黄化。

外植体材料的粗细和大小对本试验影响也较大。瘦弱的外植体基本不发芽、不生根、剪切口处局部发黑，酒精等试剂对材料的伤害严重。不生根的试管苗主要是外植体基部发黑，随着培养时间延长，愈伤组织也逐渐发黑，说明材料的粗细和大小对不同的消毒处理方式很敏感。

外植体先长出愈伤组织，然后从愈伤组织中分化出根，并且愈伤组织越多，愈伤组织越白、越干净，生根越多、越粗、越长，根系越发达。

2.1 不同消毒方式对污染率的影响

红地球品种的处理中，处理C 的效果最好，污染率为0，处理A 效果最差，污染率为33.3%，平均污染率为13.3%；阳光玫瑰的处理中，处理B 的效果最好，污染率为10%，处理A 效果最差，污染率为54.5%，平均污染率为34.8%。说明红地球葡萄品种外植体材料容易消毒，随着消毒时间的增加，消毒效果越好，污染率逐渐降低（图1、图2）。

图1 红地球综合指标统计

图2 阳光玫瑰综合指标统计

2.2 不同消毒方式对发芽率的影响

红地球品种的3 个处理中，处理B 的效果最好，发芽率达到92.3%；阳光玫瑰的3 个处理中，也是处理B 效果最好，发芽率达到80%。红地球品种的平均发芽率为91.3%，阳光玫瑰的平均发芽率为64.5%。说明5 min 0.1%升汞处理下，对外植体芽的生长最利。处理时间过长，材料容易受升汞毒害，芽的萌发推迟，甚至不发芽；处理时间过短，消毒不彻底，材料带菌，仍不发芽（图1、图2）。

2.3 不同消毒方式对生根率的影响

红地球品种的处理中，处理C 的效果最好，生根率为80%，处理B 的效果最差，生根率为30.8%，平均生根率为48%；阳光玫瑰的处理中，处理C 的效果最好，生根率为30%，效果最差的为处理A，生根率为0%，平均生根率为16.7%。说明7 min 升汞处理下的外植体材料，生根效果最好（图1、图2）。

2.4 不同消毒方式对累计根长的影响

红地球处理C 的效果最好，12 d 的累计根长为21.8 cm，效果最差的为处理B，累计根长为12.5 cm，红地球品种的平均累计根长为16.4 cm；阳光玫瑰品种的处理中，效果最好的也是处理C,累计根长为17.4 cm，效果最差的为处理A，累计根长为0 cm，平均累计根长为8.2 cm（图3、图4）。

图3 红地球立即根长统计

图4 阳光玫瑰累计根长统计

2.5 综合分析

综合观测指标显示：在70%酒精10 s+2%次氯酸钠8 min 消毒的基础上，7 min 升汞处理对红地球和阳光玫瑰品种处理效果最佳。7 min 升汞处理下，2 个品种的污染率、发芽率、生根率、累计根长等综合性状表现优良，植株长势迅速，生根量多。其中，红地球品种的污染率低于阳光玫瑰，发芽率高于阳光玫瑰，平均累计根长长于阳光玫瑰。在3 min、5 min、7 min 0.1%升汞处理下，随着消毒时间的增加，外植体的污染率明显降低，并且污染率低的成活率高。

3 讨论与结论

3.1 讨论

影响外植体污染的因素：一是消毒不彻底；二是外植体的大小和取材季节的影响，越靠近基部较低部位的外植体，污染率越低，茎尖最好，茎段最广泛；三是器官的生理状态和生理年龄，生理年龄越小，越易诱导根和芽的发生[4]；四是幼嫩的枝条越容易消毒，污染率越低；五是修剪过程中机械损伤越少，污染率越低；六是多年生木本植物和大田作物带菌多，污染率较高。

影响外植体发芽的因素：一是茎芽和根的分化取决于生长素/细胞分裂素的比例[8]；二是培养基中生长素浓度过高会抑制芽的形成[9]；三是供试材料的生理状态和芽的饱满程度，外植体中储藏的营养越多，越容易发壮芽。

影响试管苗生根的因素：一是外植体材料；二是基本培养基[10]；三是植物激素，一般生长素类能促进生根；四是继代培养代数；五是黑暗中培养比光照培养下更容易产生不定根[11]。

本试验在统计过程中存在一些误差，主要受外植体材料的大小、粗细的影响。以后的研究中应将各外植体按粗细、大小平均分级，按不同粗细程度确定最佳消毒时间。

此次消毒只是针对外植体材料表面灭菌，未能消灭材料内部细菌，未降低污染率，可在培养基中加入抗生素以降低污染。

为证实试管苗的污染是由材料带菌还是培养环境本身有菌，应在培养架上放置一个空培养基，其内不接任何外植体，最后观察该空培养基的污染状况。为降低污染，应在培养前用70%酒精在空气中喷雾，杀死空气中的部分细菌。

消毒后，用剪刀剪除一部分受伤断面后，接种后仍有一部分茎段断面发黑，说明材料的粗细程度和消毒液的渗透速度有关，如果能够把握住材料粗细和消毒液在组织内的渗透速度以及渗透速度的关系后，材料基部发黑和只发芽不生根的现象也许会扭转。

3.2 结论

试验结果表明：70%酒精10 s+2%次氯酸钠8 min+0.1%升汞7 min 处理下污染率低，生根率、发芽率、成活率高；外植体材料粗，芽眼越饱满，污染率越低，成活率越高。