生物技术在水稻育种中的应用初探

赖文昶 黄森豪 祁成民 吴仁烨

摘    要：水稻是我国主要粮食作物之一，水稻育种是一项重要的科研工作。随着科技的发展，相关人员研发出越来越多的新型生物技术，例如基因工程、细胞工程、分子标记技术、基因编辑技术等，并在水稻育种研究中得到广泛的应用，解决了育种工作中出现的许多问题。文章论述了生物技术在水稻育种中的作用，总结了生物技术在水稻育种中存在的问题，以供参考。

关键词：水稻育种;生物技术;基因工程;细胞工程;分子标记技术;基因编辑技术

文章编号：1005-2690（2022）09-0034-03       中国图书分类号：S511       文献标志码：B

水稻是稻属谷类作物，是世界上最主要的三大粮食作物之一，种植面积占世界粮食总面积的1/5。我国是世界上最大的水稻生产国和消费国，水稻产量约占全国粮食总产量的1/2。同时，水稻在酿酒、医药、工业等领域应用广泛，水稻事业的发展与国家粮食安全关系重大。

生物技术以基因工程和细胞工程为核心，包含发酵工程、酶工程等生物技术的新兴学科。目前，我国水稻育种面临病虫害频发、人多地少、选育效率低等问题，生物技术可以有效解决这些问题，被广泛应用于水稻育种中。

1 基因工程

基因工程也被称作基因拼接技术和DNA重组技术，是在分子生物学和微生物学的基础上，以分子遗传学为理论来源的现代生物技术。水稻基因工程育种是把需要的目的基因克隆转移到水稻上，进而实现对水稻遗传特性的改良。同时，通过建立完善高效的遗传转化体系，对优良的目的基因进行整合和表达，使之稳定地遗传给下一代[1]。在基因转化过程中常被使用的外植物体包括愈伤组织、原生质体和根尖、茎尖等组织器官，水稻的幼穗、幼胚和花药等愈伤细胞往往作为基因转化的受体。

目前，水稻转基因包括抗病性基因、抗虫性基因、抗除草剂基因、抗逆性基因以及品质改良基因等。促进水稻基因工程育种的发展对于培育高产、抗病、抗虫、抗逆的新型水稻品种，对推动农业生产的可持续发展具有重要意义。

1.1 基因枪法

基因枪法是利用高压放电、压缩气体等方法产生的巨大动力，使黏有目标DNA的高速金（鎢）微粒轰击进入靶细胞，再通过未知机制，将外源DNA导入植物染色体上实现基因转移的技术。

基因枪法的可控度较高，可根据需要将金属颗粒射入特定的细胞，并且不受宿主的限制。但基因枪轰击位点的随机性和整合位点的不固定性，大大增加了基因突变、丢失和基因沉默的可能性，影响了外源基因在生物体内的稳定表达。

1.2 花粉管通道法

花粉管通道法也被称为授粉后外源基因导入植物技术。在植物完成授粉后，柱头部位的花粉会形成一个花粉管通道，然后采用人工方法将外源DNA转移至胚囊。由于受精卵和生殖细胞仍处于未形成细胞壁的“原生质体”状态，外源DNA片段容易进入、整合到原有的基因组中，达到遗传转化的目的。

当前流行的方法包括花粉管直接携带法、花粉匀浆涂抹柱头法、自花授粉后导入法、受体花粉及供体DNA混合授粉法等。

1.3 农杆菌介导法

农杆菌是在土壤中普遍存在的一种革兰氏阴性菌，能够在自然条件下有选择地感染大多数双子叶植物的受伤部位，产生根癌农杆菌和发根农杆菌。具体过程是将根癌农杆菌Ti质粒和发根农杆菌Ri质粒中的一段T-DNA插入到植物基因组中，进而对水稻的性状进行改良[2]。

1.3.1 农杆菌介导水稻的优点

与基因枪法、花粉管通道法相比，农杆菌介导法是最经济、操作最为简单的方法。农杆菌介导法利用天然的载体转化系统，具有高效率、高成功率的特点。外源DNA有明显的转化机理，能够在转化过程中保持稳定。外源基因在植物器官内进行特异性表达，可进行人为控制。

通过农杆菌介导转入的外源DNA结构完整，反应机理清楚，整合位点稳定。经过Ti质粒转化系统转化的外源大多以单拷贝为主，且符合孟德尔遗传定律。因此通过农杆菌介导法获得的植物大多被应用于育种的中间选育材料。T-DNA含有能够被植物体识别的功能启动子和转录信号，能够使外源DNA和T-DNA一同在植物体内表达[3]。

1.3.2 农杆菌介导水稻的缺点

存在再生细胞感受态与转化细胞感受态不一致的情况。农杆菌可能会使检测结果出现假阳性。农杆菌介导目前仅在双子叶植物中被广泛应用，对于单子叶植物的转化仍比较困难。

2 细胞工程

2.1 细胞工程育种简述

细胞工程的主要理论支撑和思想来源是Haberlandt在20世纪初提出的植物细胞全能性，是指植物体的每个体细胞都携带一整套完整的植物基因组，在理论上具备发育成一个完整植株的能力。

在细胞水平上对植物细胞进行融合，再通过细胞核质移植、染色体移植等操作，培育植物新品种、改善植物性状或引入新性状。当前流行的细胞工程技术主要有无性系筛选、原生质体培养、体细胞杂交、花药培养和多倍体育种等。

植物学家曾运用细胞工程技术杂交两种植物的体细胞创造出一个新细胞，对其进行单细胞培养，让先分裂分化为组织，进而发芽生根，最后发育成新植物，新植物同时具有亲代的各自特征，而且在外观上很像亲代植物的组合体。

更有生物学家幻想将动物细胞与植物细胞相融合，让动物具有植物的叶绿体，使其具有光合作用，能够自己合成营养物质。除此之外，还有许多基于细胞工程得以实现的成果，目前细胞工程的许多技术已十分成熟，且广泛应用于各个领域。

2.2 细胞工程育种的特点

细胞工程育种可以改良旧植物品种或产生新植物品种，筛选出良好性状的植物品种，改善植物的生长速度、繁殖速度，实现种子脱毒。运用细胞工程技术改良的植物可以稳定遗传性状，加快育种进程，提高育种效率，缩短育种年限。体细胞融合技术和杂交技术等新技术的出现，可以帮助相关人员克服植物间远缘杂交不亲和的问题。

2.3 细胞工程技术在水稻育种中的应用

早在20世纪70年代，我国便开始将细胞工程技术运用于水稻育种。先是中国科学院尝试将水稻花粉离体培养，不久中科院遗传所率先使用单倍体育种法先后培育出两个新品种水稻，在之后的50多年里，我国育种专家不断将各种细胞工程技术运用到水稻育种中，如今许多技术已相当成熟并实现了广泛应用[4]。例如，水稻的花药培养技术不仅应用于常规育种与杂交育种，而且在水稻“恢复系”和“不恢复系”材料的选育方面也发挥了重要作用。

3 分子标记技术

3.1 分子标记技术的简介及原理

DNA分子标记技术是一种依靠基因组DNA中核苷酸排列顺序的差异示位、追踪、显示不同个体之间所潜藏的遗传变异差异的生物技术[5]。分子标记最早出现要追溯到20世纪80～90年代SSR技术（Simple Sequence Repeat：简单重复序列）和RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism：限制性片段长度多态性）的横空出世。

前者是依靠当时已经成熟的PCR技术（Polymerase Chain Reaction）和微卫星DNA特性的标记技术，原理是在真核生物基因组上会出现短串联重复序列这一序列，又称微卫星DNA，不同个体之间的重复序列长度不同，根据这一差异可以在微卫星序列的两端设计引物，再通过PCR技术对微卫星序列进行大量扩增。因为不同个体间的序列长度不同，所以使用PCR技术扩增出的序列长度也有所不同，因此电泳出的条带大小也不同。

RFLP技术比SSR技术更早，早在1974年Grodzicke等人就创立了RFLP技术，其建立在DNA杂交技术原理的基础上，同时也是最早广泛应用的分子标记技术。分子标记技术首先使用特定的限制性内切酶对整个基因组进行切割，得到长度不同的DNA片段，再通过southern杂交和放射性影像显示得到相应的图谱，不同图谱能反映出不同个体间酶切位点的多态性。RFLP技术因为其共显性与特定位点的多样性，在遗传图谱的构建、遗传育种、临床医疗诊断等许多领域得到广泛应用。

3.2 分子标记技术的特点

分子标记技术相对于其他标记技术来说优点突出，分子标记技术受环境影响较小、稳定性较高、准确性高、多态性强。分子标记技术以基因突变为基础，分子标记的数量众多且分布较广，从理论的角度出发，标记的数量几乎是无限的，生物发育的各个时期，不同器官、不同组织的DNA都可以用作于分子标记分析。

大多数DNA分子标记具有共显性，利用这一特点能够鉴定和识别杂合子与纯合子的基因型。分子标记的表现为中性，对表达目标性状的影响几乎为零，并且与不良性状不存在任何连锁关系，最重要的是操作简单、检验迅速。

3.3 分子标记技术在水稻遗传育种中的应用

通过分子标记技术进行基因定位、基因型鉴定、目的基因筛选、基因克隆等操作都是育种过程中所需要的，分子标记技术不仅提高了准确性及选择效率，还缩短了育种周期与育种年限，具有很强的目的性，在水稻的遗传育种中应用非常广泛。

分子标记技术在水稻的抗病虫育种中同样发挥了重要作用，在抗病基因的选择上得益于分子标记技术辅助，准确率和精确率得以大大提高。尤其在抗稻瘟病的研究中發挥了非常重要的作用。

我国科学家郑祥正等发明了一种名叫InDel的标记，该标记能够准确实现抗病基因和非抗病基因的基因分型，大大简化了水稻抗稻瘟病种质的筛选工作[6]。陈红旗等通过分子标记技术在保持系金23B中导入基因Pi-1，Pi-3（抗稻瘟病基因），使其达到了96.7%的抗病率[7]。

分子标记技术还可以帮助构建水稻的分子遗传图谱，以分子标记技术为工具，通过目的基因分子标记之间的紧密连锁实现目的基因的定位，构建出水稻的高密度的遗传连锁图谱。1988年McCouh率先构建了第一张水稻遗传图谱，Causse等和Harushima等紧随其后分别完成了不同标记数量的高密度遗传连锁图谱的构建工作，在之后的30多年间标记位点数目不断增加，已经达到326个RFLP标记，公布的水稻SSR标记达到14 000多个，基本实现了基因组的全部覆盖。

4 基因编辑技术

4.1 基因编辑技术的简介及特点

基因编辑也被称作基因组编辑（genome editing）或基因组工程（genome engineering），是一种能够准确修饰生物体特定目标基因的新兴技术。基因编辑技术是利用去除或添加基因、替代基因、定点突变等方式修饰原有的基因，改变物种原有的基因型，进而实现物种性状的改变。目前，比较流行的基因编辑技术包括一代ZFNs基因编辑技术、二代TALENs基因编辑技术和三代CRISPR/Cas9基因编辑技术[8]。

4.2 基因编辑技术在水稻育种中的应用

目前，大量试验数据表明，基因编辑技术与水稻育种速率和效率密切相关。利用CRISPR/Cas9技术培育的水稻具有较高的出苗率。覃玉芬等通过CRISPR/Cas9技术系统编辑水稻品种GXU41中TMS5的两个靶点位，获得纯合突变的T0代阳性植株，并在T1代获得到无外源标记的植株。表明该技术能够提高得到TGMS系效率。

随着生活水平的提高，人们对水稻的口感和香糯程度也有了更高的要求，基因编辑技术恰恰使这一目标成为现实。现阶段，可使用基因编辑技术改良人们所需的水稻性状，从而将水稻中直链淀粉的含量达到最适水平[9]。

5 生物技术在水稻育种中存在的问题与展望

虽然当前生物技术在水稻育种中得以广泛应用，取得了较大进展，但仍存在一些现实性问题亟待解决。我国缺乏高效完整的基因发掘技术，对于实用分子的标记仍处于空白，一些重要的目标性状基因急需标记。水稻花药培养技术仍处于发展阶段，水稻的出愈率、绿芽分化率较低，后期可能会影响后代的基因型表达。应用生物技术培育的水稻虽然实现了目标性状的转移，但要想应用于生产必须通过常规育种进行加工。农杆菌介导技术无法同时标记多个目标性状，农艺产品无法满足市场对品种的需求[10]。

因此，要加快水稻基因工程与细胞工程的结合，充分利用我国丰富的水稻种质资源，建立优良的水稻核心种质资源基因库，利用分子标记技术对不同的种质进行遗传多样性评价，构建以农家稻、野生稻、恢复系、不育系为核心的种质，为我国水稻发展提供源源不断的种质资源。将生物技术和常规育种相结合，使用回交方法将导入基因转入生产品种中，或通过常规品种和转基因品种的杂交，利用系谱法选出新品种。

只要抓住生物技术发展的契机，充分做足理论、技术的准备，就能利用生物技术实现水稻优质、高产、广适应性改良的目标，更好地缓解粮食供给侧结构矛盾，促进我国水稻产业增效提质。

参考文献：

[1]张文银，杨生明.水稻基因工程育种现状及其展望[J].宁夏农林科技，2008（6）：105-106.

[2]秦洁.生物技术在玉米育种中的应用研究[J].农业技术与装备，2021（5）：50-51.

[3]潘素君，戴良英，刘雄伦，等.农杆菌介导的遗传转化在水稻基因工程中的应用[J].中国稻米，2007（3）：10-14.

[4]程式华.中国水稻育种百年发展与展望[J].中国稻米，2021，27（4）：1-6.

[5]高美凤，王曉峰，夏莲红，等.3种水稻分子标记辅助育种技术的应用概况[J].上海农业科技，2017（5）：49-51.

[6]张金霞，刘贺梅，孙建权，等.分子标记技术在水稻品种改良中的应用[J].中国种业，2021（9）：14-18.

[7]戴扬，熊怀阳，黄剑.分子标记技术在水稻育种中的应用分析[J].农业开发与装备，2020（11）：54-55.

[8]李萌，姜恭好，段海燕.基因编辑技术在水稻遗传改良中的应用进展[J].南方农业，2021，15（34）：7-11，19.

[9]覃玉芬，廖山岳，郭新颖，等.利用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制新型水稻温敏雄性核不育系[J/OL].[2022-02-19].http//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210402.1611.016.html.

[10]张文银，安永平，王彩芬，等.水稻生物技术育种现状及其展望[J].种子，2008（11）：60-63.