正交试验法优选金贝化痰颗粒中黄芩苷的提取工艺

杨晓日 姜慧祯 张 力 王军栋 顾家珲 杜丽君 孙丽凤▲ 孙琦雅.山东省烟台市中医医院药剂科，山东烟台 64000；.山东省烟台市食品药品检验检测中心，山东烟台 64003

金贝化痰汤剂是烟台市中医医院的临床经验方，由瓜蒌、黄芩、法半夏、浙贝母、炙麻黄、苦杏仁、桔梗、金银花、连翘等中药组成。 临床上用来治疗慢性阻塞性肺疾病、肺炎、支气管扩张、急性支气管炎等呼吸系统疾病、证属痰热蕴肺证[1-5]，临床实践多年，疗效显著。但是由于传统汤剂存在保存期短、易发霉变质、服用剂量大等缺点，为了克服以上缺点，同时也为了更好地提高疗效，有效地控制生产质量，课题组拟将其研制成颗粒制剂，即金贝化痰颗粒[6-8]。 本实验对金贝化痰颗粒中黄芩苷的提取工艺进行优化研究，根据传统制备工艺结合烟台市中医医院制剂室生产的实际情况采用水提取工艺，以金贝化痰汤剂处方的出膏率和处方中君药黄芩的有效成分黄芩苷的提取率为指标[9-10]，优选金贝化痰颗粒的最优水提取工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器及试剂

1260 Infinit Ⅱ高效液相色谱（安捷伦科技有限公司）；KEJ-1000 超声波清洗机（张家港科净超声洗净设备有限公司）；SHB-Ⅲ型水循环多用真空泵（上海亚荣有限公司）；EL-204 型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；DHG-9070A 型电热恒温水浴锅（江苏常熟医疗器械厂）；电热干燥箱（上海一恒实验仪器总厂）。

黄芩苷（中国食品药品检定研究院，批号为1100715-201318）；甲醇（色谱纯，美国TEDIA 公司）；其余试剂均为分析纯。

1.2 试药

依据2015 版 《中华人民共和国药典》（一部）[11]，测定处方药材的有效成分含量，结果见表1。 结果显示，处方药材的有效成分含量测定结果全部合格。

表1 药材含量测定结果

2 方法与结果

2.1 黄芩苷含量的测定

2.1.1 色谱条件 1260 Infinit Ⅱ高效液相色谱；色谱柱：Agilent EC-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；以十八烷基键合硅胶为填充剂；以甲醇:水:醋酸溶液（47∶53∶0.2）为流动相；检测波长为280 nm；流速为1.0 ml/min；柱温为25℃。 在此色谱条件下，黄芩苷与相邻色谱峰的分离度为6.6； 理论板数按黄芩苷峰计算不低于2500。 阴性对照色谱对测定无干扰。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称定黄芩苷对照品，在60℃减压干燥4 h， 加甲醇制成60.9 μg/ml 的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 金贝化痰汤剂的处方为：瓜蒌6 g，黄芩4 g，法半夏4 g，浙贝母4 g，炙麻黄3 g，前胡3 g，金银花8 g，连翘3 g，芦根5 g，紫苏叶3 g，蜜枇杷叶3 g，苦杏仁3 g，桔梗4 g，厚朴3 g，桃仁3 g，生姜4 g，大枣3 g，甘草2 g。 按处方比例称取药材68 g，按实验设计表加入水进行回流提取，用水定容至1000 ml 摇匀，取75 ml 提取液水浴蒸干，残渣加70%的乙醇40 ml 回流提取3 h， 提取液用70%的乙醇定容至100 ml 摇匀，取1 ml 用70%的甲醇定容至10 ml，摇至均匀，以0.45 μm 的微孔滤膜滤过，即得。

2.1.4 空白溶液的制备 称取处方中除黄芩外的其余药材，用8 倍量水回流提取2 次，每次1 h，合并两次提取液，加水定容至1000 ml，摇匀，过0.45 μm 的微孔滤膜滤过，即得。

2.2 线性关系考察

分别精密吸取203 μg/ml 黄芩苷贮备液各0.2、1、1.2、2、3 ml 至10 ml 量瓶中，稀释后得对照品溶液，按照“2.1.1”项下方法进样10 μl 进行色谱测定，得到峰面积。 以对照品的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标， 得到回归方程和相关系数：Y=11.859X-14.98，r2=0.9993，黄芩苷在4.06～24.36 mg/ml 范围内线性关系良好。

2.3 空白试验

取“2.1.4”项下的黄芩空白溶液、“2.1.2”项下的黄芩苷对照品溶液、“2.1.3”项下的供试品溶液各10 μl，按照“2.1.1”项下条件进样10 μl 进行色谱测定，色谱图结果见图1。 结果显示，供试品溶液、黄芩苷对照品溶液均在7 min 左右出现了黄芩苷特征吸收峰，黄芩空白溶液则在此处无干扰，表明方法专属性良好。

图1 黄芩高效液相色谱图

2.4 稳定性试验

取“2.1.3”项下供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h，按照“2.1.1”项下条件进样10 μl 注入高效液相色谱仪进行色谱测定，测得峰面积，其峰面积平均值为60.307，其RSD 为2.25%（n=6）。 结果表明，供试品溶液在24 h 内基本稳定。

2.5 重复性试验

取“2.1.3”项下同一供试品6 份各10 μl，按照“2.1.1”项下条件进样10 μl 进行色谱测定，得到黄芩苷含量，其RSD 为0.5%（n=6）。

2.6 精密度试验

取“2.1.2”项下的黄芩苷对照品溶液，按照“2.1.1”项下条件进样10 μl 进行色谱测定，连续进样5 次，测定峰面积，计算平均峰面积为696.114，其RSD 为0.06%（n=5）。

2.7 加样回收率试验

取已知含量的供试品，共5 份，精密称定，各加入黄芩苷对照品0.95 mg，按照“2.1.3”项下方法制成供试品溶液，按照“2.1.1”项下条件进样10 μl 进行色谱测定，依次测定各份样品中黄芩苷的含量，结果见表2。结果显示，平均加样回收率为99.80%，其RSD 为1.05%。

表2 黄芩苷加样回收率试验结果

2.8 出膏率的测定

精密量取“2.1.3”项下供试品溶液25 ml 置蒸发皿（已干燥至恒重）中，100℃水浴蒸干后，置于105℃干燥箱中干燥3 h，再移置干燥器中，冷却30 min，迅速精密称定重量，得到出膏率。其中出膏率＝干膏质量（g）/药材总质量（g）×100%[12]。

2.9 提取工艺优选

2.9.1 单因素分析与正交试验设计 参考文献[13-17]，影响提取的因素有提取时间、提取次数、溶媒及用量等，以黄芩苷含量为指标，采用回流提取法提取，进行单因素考察，取处方量药材，分别加入4、6、8、10、12 倍水，回流提取2 次，每次1 h，结果显示，超过10 倍水量后黄芩苷含量不再增加；取处方量药材，加入10 倍水，分别回流提取1、2、3、4 次，每次1 h，结果显示，提取次数超过3 次后黄芩苷含量增加不明显。取处方量药材，加入10 倍水，回流提取3 次，提取时间每次分别1、1.5、2、3 h，结果显示，当超过2 h 后黄芩苷含量增加不明显。

2.9.2 提取工艺优选 在单因素试验结果的基础上设计正交试验，选取提取时间、提取倍数和提取次数作为考察因素，毎个因素选取3 个水平，以黄芩苷转移率（黄芩苷转移率＝提取液中指标成分含量/药材中指标成分含量×100%）和出膏率为评价指标，选用L9（34）正交表安排试验，对多指标进行综合评价，黄芩苷转移率和出膏率的权重系数分别占0.5。 因素水平见表3，L9（34）正交试验结果见表4，方差分析结果见表5。

表3 因素水平表

对试验结果进行直观分析，表4 中R 值的大小提示各因素对综合评分的影响大小依次均为： 提取次数（因素C）＞提取时间（因素B）＞加水量（因素A）。由表5 方差分析结果可知，提取次数（因素C）对综合评分的影响有统计学意义（P＜0.05），而加水倍量（A）和提取时间（B）的影响则差异无统计学意义（P＞0.05），结合表4 中K 值大小，因素A 加水量选择K3，因素B 提取时间选择K3， 因素C 提取次数选择K3，因此，最优工艺确定为A3B3C3，即加10 倍量水，每次2 h，提取3 次。

表4 L9（34）正交试验结果

表5 方差分析结果

2.10 最佳工艺验证试验

按照分析的最佳工艺（加10 倍量水，每次2 h，提取3 次）进行验证试验，结果见表6。 验证试验结果显示，最佳工艺中黄芩苷的平均转移率为78.96%，RSD为4.035%； 平均出膏率为47.48%，RSD 为1.11%，提示此提取工艺稳定可行。

表6 最佳工艺验证试验结果

3 讨论

合理地选择中药处方的提取工艺及指标是保证原方药效的关键。黄芩为金贝化痰颗粒处方的君药，主要成分黄芩苷具有抗病原微生物、解热、抗炎、抗菌等多种生理活性和药理作用[18-20]。 故选中药处方常用的出膏率和黄芩的有效成分黄芩苷的转移率作为考察指标，筛选金贝化痰颗粒中黄芩苷的最优提取工艺。

测定黄芩苷时，笔者对不同厂家、不同类型的C18柱进行了考察，结果显示，用Agilent EC-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）时，黄芩苷的峰形和分离度良好。故本实验选择用Agilent EC-C18柱。同时在选择流动相时，参照药典法的流动相甲醇:水:醋酸溶液（47∶53∶0.2），试验结果显示，黄芩苷的峰形和分离度良好。 故选择甲醇:水:醋酸溶液（47∶53∶0.2）为流动相。

本文采用L9（34）正交试验考察提取工艺黄芩苷提取率的影响， 以高效液相色谱法对黄芩苷的含量进行检测，综合生产、经济等因素，优选最佳提取工艺。 结果显示金贝化痰颗粒中黄芩苷的最优水提取工艺为加入10 倍量水，提取3 次，每次2 h。 并经验证此提取工艺稳定可行，方法操作简便、有效，可为下一步的金贝化痰颗粒的成型工艺和质量标准研究提供依据。