马铃薯StCDPK8 基因功能预测与分析

张 莹 ，杨志坚 ，王一好 ，张文鹏 ，白江平 ，毕真真 *

（1.甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州 730070）

近年来，非生物胁迫是制约马铃薯生产的因子之一，其中干旱胁迫造成的马铃薯产量损失位居第一[1]。干旱胁迫通常发生在土壤水分不充足，难以维持植物正常生活和蒸发过度充足的地区[2]。水分缺乏是限制植物伸长和扩张生长的限制因素，也是影响植物生长发育的主要因素[3-4]，并且加速土壤营养物质供应的失衡，从根本上导致了作物生育周期中每一个环节受到影响[5]。

马铃薯是第四大粮食作物，也是一种典型的对水敏感的温带性作物，干旱生理胁迫严重阻碍了马铃薯的生长发育[6]。马铃薯生长在低温冷凉的环境下，对缺水比较敏感，缺乏有效的耐旱性机制[7]。由于全球气候的变化，马铃薯培育基地旱情日益严重，水分短缺极度限制马铃薯生长，造成减产。干旱加剧使叶片出现发黄、逐渐萎蔫、脱落等现象，对马铃薯植株造成不可逆伤害，进而影响马铃薯品种和产量，研究马铃薯抗旱基因的抗旱机理对选育马铃薯耐旱品种的选育和扩大推广具有指导意义。

CDPKs 最初在豌豆中被发现[8]，是一类存在于某些植物中专有的与逆境信号传递关系最密切的蛋白激酶[9]，在调节作物生长发育、生物和非生物胁迫的耐受性以及激素信号转导中发挥重要作用[10]。崔喜艳等[11]和牛娟等[12]的研究证实了在干旱胁迫条件下CDPK 基因在拟南芥、羊草和大豆中的表达各有所不同，在植物遭受干旱胁迫反应时起到使CDPK 基因的表达增强的重要的作用[13]。马铃薯StCDPKs 基因家族基因结构是相似的，EF-hand 在区域内高度保守[14]。StCDPKs在不同组织中遭受逆境胁迫有不同的表达模式。模式植物拟南芥AtCDPK1 基因在抗非生物胁迫反应过程中发挥正向调节作用并可以诱导表达，通过NCBI 网站BLAST 比对找到AtCDPK1 基因在马铃薯中的同源基因是StCDPK8。本试验通过生物信息学分析推测马铃薯StCDPK8 基因的功能，同时分析抗旱性不同的2 种马铃薯品种中StCDPK8 基因的瞬时表达量，以期为马铃薯抗逆种质资源基于植物基因工程上的改良提供实验依据，同时为马铃薯CDPK 蛋白生物学功能和抗旱育种的全面研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

马铃薯干旱敏感型品种大西洋（Atl）和耐旱型品种青薯9 号（QS9）2 种试验材料均由甘肃省干旱生境作物学重点实验室以及甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室提供。

MS 液体培养基，200 mm 甘露醇，植物总RNA 提取试剂盒，1%的琼脂糖凝胶电泳，成像分析系统，TOYOBO 牌反转录试剂盒，PCR 仪，荧光定量仪，超微核酸蛋白分析仪。

1.2 试验方法

1.2.1 生物信息学分析 通过在线网站对StCDPK8基因进行信息学在线分析解析StCDPK8 基因功能（表 1）。

表1 生物信息学分析网站及功能

1.2.2 干旱胁迫瞬时处理 在配制好的MS 液体培养基中将种抗旱性不同的马铃薯试管苗进行干旱短期处理：干旱敏感型品种大西洋（Atl）和耐旱型品种青薯9 号（QS9）培养25 d，然后将马铃薯试管苗放置在浓度为200 mM PEG 的MS 液体培养基中做瞬时处理，分别于 0 h（CK）、1 h、3 h、6 h、12 h 进行取样。

1.2.3 RNA 提取与检测 提取干旱胁迫瞬时处理后的马铃薯样品的RNA，并利用琼脂糖凝胶电泳检测其质量[15]、纯度[16]。

1.2.4 qPCR 检测 使用TOYOBO 反转录试剂盒进行合成 cDNA，根据 SYBR qPCR MIX（Takala）操作规程说明书建立20 μl 的荧光定量PCR 反应体系，在实时定量PCR 仪上进行扩增。最后应用2-ΔΔCT相对定量法[17]计算StCDPK8 基因的相对表达量。

所用基因引物序列：

StCDPK8-F:5’-GCTAATGGGTATAGGGCAGGAA-3’

StCDPK8-R:5’-ACAGTAACAGGAACAGGGTGGG-3’

内参基因引物序列：

actin-F:5’-AGGAGCATCCTGTCCTCCTAA-3’

actin-R:5’-CACCATCACCAGAGTCCAACA-3’

2 结果与分析

2.1 启动子顺式调控元件

利用Lantcare 分析StCDPK8 基因上游1 500 bp中含有的相关顺式作用元件（表2），结果表明：StCDPK8 基因启动子区含有启动子核心元件、瞬时顺式作用调控元件、启动子，增强子常见顺式作用元件和脱落酸反应元件等其他与胁迫调控有关的顺式作用调控元件。因此，StCDPK8 可能在马铃薯植株遭受干旱等逆境胁迫时发挥调控作用。

表2 StCDPK8 基因启动子顺式调控元件分析

2.2 蛋白结构域分析

通过InterPro 对马铃薯StCDPK8 的蛋白序列进行分析。由表3 可知，马铃薯StCDPK8 蛋白序列包含2 个结构域、1 个活性位点、2 个超同源家族以及3 个结合位点。

表3 StCDPK8 蛋白序列分析

2.3 蛋白理化特性分析

ExPASy 网站分析结果表明（表 4）：StCDPK8 基因编码581 个氨基酸，且氨基酸组分中数目最多，含量最高的是甘氨酸（Gly），含量达8.4%；色氨酸（Trp）含量最低，达0.9%。该蛋白的理论等电点（pl）为5.54，相对分子量为64.5 kD。同时，氨基酸亲水性分析显示，StCDPK8 蛋白序列的N 末端是甲硫氨酸（Met），其不稳定系数（II）是 36.41，为稳定性蛋白；理论半衰期30 h；脂肪酸指数为77.33；蛋白质的亲水性平均值GRAVY 为-0.420，为亲水性蛋白质：StCDPK8 氨基酸亲疏水性分析结果图中峰值“＞0”部分是疏水区域，“＜0”部分则为亲水区域，该序列在 305 至 315 处存在最高峰（图 1），StCDPK8 氨基酸疏水性达到最大。

图1 StCDPK8 氨基酸亲疏水性分析

表4 StCDPK8 蛋白氨基酸序列分析

2.4 蛋白质高级结构预测

根据Plantcare 分析结果预测到：α 螺旋和无规则卷曲是StCDPK8 蛋白二级结构的主要成分，还包括β 折叠和延伸链以及其他已知的结构域（图2、图3）。通过SOPMA-蛋白质二级预测结果显示，α螺旋占比42.51%，无规则卷曲占比39.24%，β 折叠占比8.61%，延伸链占比9.64%。通过分析马铃薯StCDPK8 蛋白的三级结构（图 4），结果表明：α- 螺旋和无规则卷曲是该三级结构的主要组成部分。因此，马铃薯StCDPK8 蛋白的大部分氨基酸序列都为螺旋形状。同时，基于同源建模三维结构分析结果表明：StCDPK8 蛋白可能含有较大的疏水结构，与二级结构预测形式吻合。

图2 StCDPK8 蛋白的二级结构预测图

图3 StCDPK8 蛋白的二级结构峰图

图4 StCDPK8 蛋白的三维结构模型

2.5 StCDPK8 基因表达量分析

对甘露醇模拟干旱胁迫处理后的幼苗进行qPCR 分析，由图5 可看出：干旱处理后，2 个马铃薯品种中StCDPK8 表达量均迅速升高，并在1 h 时达到最高；且耐旱型品种QS9 的表达量整体高于干旱敏感型品种Atl。干旱处理使StCDPK8 基因的表达量在抗旱性不同的马铃薯中表现出品种特异性，根据该基因表达量的品种差异性推测马铃薯StCDPK8基因与马铃薯干旱胁迫响应有关。

图5 干旱胁迫处理下2 种马铃薯中StCDPK8基因表达量变化

3 讨论

植物中的CDPKs（钙依赖蛋白激酶）作为一个正向调节因子调控干旱等逆境反应，能快速适应非生物胁迫，与植物的胁迫响应有着密切关系。CDPKs 是一类参与植物天然免疫反应的钙离子感受器，它还是一种通过调节转录因子来调控基因表达情况的抗性基因[18]。已有研究证实[19]，在干旱等非生物逆境胁迫下拟南芥AtCDPK1（AT5G04870）基因被诱导表达，进而激活其过量表达以显著提高植物对非生物胁迫的耐受能力。马铃薯抗旱性是一种需要从与抗旱胁迫响应相关基因进行发掘的研究，它作为一种由复合的多基因控制的数量遗传特征为马铃薯抗旱品种在干旱胁迫下的培育提供一定实验基础，减少干旱造成的损失。

本试验通过NCBI BLAST 比对找到马铃薯中的拟南芥AtCDPK1 同源基因StCDPK8，初步推测StCDPK8 基因与AtCDPK1 基因功能在受干旱、高盐等逆境胁迫诱导时表达相似，并且在激素信号转导过程中与马铃薯的生长发育响应。目前对马铃薯干旱相关钙依赖蛋白激酶的研究较少，本试验通过生物信息学手段和基因表达分析对StCDPK8 进行初步功能预测，以期为马铃薯干旱相关CDPKs 进行进一步功能解析提供参考。生物信息学分析结果显示，StCDPK8 蛋白作为稳定性蛋白，其启动子上游序列主要参与植物逆境反应，包括与免疫应答和激素信号传导途径转导等相关的顺式作用元件，表明StCDPK8 可能参与植物逆境应激反应[9]。模拟干旱胁迫下抗旱性不同的马铃薯品种中StCDPK8 基因的表达水平有显著差异，推测StCDPK8 基因可能在马铃薯干旱响应过程发挥重要的作用。本研究结果为进一步解析马铃薯StCDPK8 基因响应干旱胁迫的信号通路和调控机理提供了理论依据，为马铃薯CDPKs蛋白生物学功能的深入研究提供参考。

4 结论

本研究根据对马铃薯StCDPK8 基因的生物信息学在线分析结果显示，StCDPK8 基因启动子上游序列中含有与激素信号转导、免疫应答等相关的顺式作用元件，表明马铃薯StCDPK8 基因可能参与植物胁迫逆境响应。干旱胁迫瞬时处理后，抗旱性不同马铃薯品种中StCDPK8 基因表达量差异显著，推测该基因与马铃薯干旱逆境胁迫响应有关。本研究结果可为基于植物基因工程上的改良提供实验依据，同时为马铃薯CDPKs 蛋白生物学功能和抗旱育种的全面研究提供参考。