响应面法优化超声协同ZnO NPs处理对鲜切莴笋的保鲜效果

徐为雯，王顺民，罗 丽，王思蒙，彭文苹

(安徽工程大学 生物与食品工程学院，安徽 芜湖 241000)

鲜切食品具有方便、多样的特点，可以满足人们日益快节奏的生活方式[1]。例如莴笋常被切割成不同的切块进行市场售卖，即食的鲜切莴笋因其酥脆的口感和独特的香气在火锅中非常受青睐[2]。但随着市场的扩大，鲜切食品的保存也成为其中关键问题。鲜切食品贮藏过程中最常见和最严重的问题是组织褐变。其次鲜切食品在采后的处理和加工过程中更易受微生物感染，导致其货架寿命短，质量差[3]。加工新鲜莴笋的操作，如切割和干燥，都会使其组织损伤，导致质量迅速恶化和保质期缩短[4]。因此，降低鲜切莴笋质量损失，从而延长其保质期是有意义的[5]。

超声波作为一种新颖、安全的技术，被广泛应用于食品加工和储藏[6-9]。频率高于16 kHz的高功率超声波具有机械、化学和生化效应，可用于改变不同食物系统的理化性质[10]。当超声通过生物结构传播时，会引起介质粒子的压缩和凹陷，发生许多物理、化学和生化效应并产生大量的能量，这使得超声的各种应用成为可能。在食品工业中，超声波的使用不仅可以清洁食物表面，还能杀死细菌，灭活病毒[11]。研究表明，经超声处理的番茄能保持良好的贮藏品质[12]，超声处理过的梅子细菌计数减少了0.42～1.47 logCFU/g[13]。超声波也常常被用于保存鲜切食品[3]。虽然超声处理有利于减少微生物，延长鲜切食品的保质期，但仅用超声处理效果有限。研究表明超声与其他方法相结合是一种加强鲜切食品保鲜效果的更高效方法[14]。因此，鲜切产业已尝试用超声与其他保鲜方法，如有机酸、精油、臭氧或消毒剂相结合，以提高保鲜效果[3]。人们也正在寻找更加新颖的材料或技术与超声相结合来加强保鲜效果[15]。

近年来，功能性金属氧化物经美国食品药品管理局(21CFR182.8991)批准已被用于改善薄膜的力学和抗菌特性[16]。其中纳米氧化锌(ZnO NPs)由于其低毒性作为锌补充剂和抗菌剂被广泛应用于食品工业中，以延长果蔬的贮藏时间[17-21]。ZnO NPs能够作为抗菌剂使用，一是由于ZnO NPs表面与水反应产生羟基自由基(OH)或过氧化氢，二是ZnO NPs可以在紫外区域获得光子能量，形成电子和空穴对，进一步与水和氧气反应产生活性氧进行杀菌[22]。ZnO NPs在作为抗菌剂时甚至很少表现出介导的细菌耐药性和低细胞毒性[23]。

目前关于超声波、ZnO NPs溶液单独对鲜切莴笋保鲜效果影响的报道较多，但是超声协同ZnO NPs处理对鲜切莴笋保鲜效果影响的报道相对较少。本研究采用超声波、ZnO NPs溶液对鲜切莴笋分别进行单因素保鲜处理，再利用响应面试验对超声协同ZnO NPs进行条件优化，探索上述方法对鲜切莴笋保鲜效果及品质指标的影响，从而为进一步提高鲜切莴笋的保鲜效果提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试紫叶“金农”莴笋购自芜湖镜湖区新城中心蔬菜市场。选取大小均一、表面无机械损伤、内部无空心、无病虫害的新鲜莴笋,采购后立即运回实验室。丙酮、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；ZnO NPs(Merk-aldrich化学试剂公司)。

1.2 主要仪器与设备

手持式精密色差仪(CHINSPEC，中国彩谱仪器有限公司)；液晶超声波清洗器(KS-100DE，昆山洁力美超声仪器有限公司)；可见分光光度计(L3S，上海仪电分析仪器有限公司)；电子天平(JY1002，上海精密科学仪器有限公司)；医用离心机(TGL-16A，长沙平凡仪器仪表有限公司)。

1.3 试验方法

(1)材料处理。将挑选好的莴笋随机分为6组，去叶清洗后晾干去皮，切成片状(厚度为0.4 cm)分别用蒸馏水及不同条件的5个因素水平浸泡处理10 min，晾干后分装于8 cm×12 cm×5 cm聚乙烯(PE)一次性密封塑料袋中，每袋约10 g，置于4 ℃、相对湿度为45%～75%条件下冷藏。

(2)单因素试验。①前期处理好的鲜切莴笋分别在超声功率为100、200、300、400、500 W，超声温度为45 ℃条件下，超声处理10 min；②前期处理好的鲜切莴笋分别在超声温度为25、35、45、55、65 ℃，超声功率为300 W条件下，超声处理10 min；③前期处理好的鲜切莴笋在超声功率300 W和超声温度45 ℃条件下，分别超声处理3、5、10、15、20 min；④前期处理好的鲜切莴笋分别在ZnO NPs溶液浓度为0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 g/L条件下浸泡10 min；分别于贮藏0、2、4、6、8 d时取样测定鲜切莴笋的4个品质测定指标(失重率、感官评价、a*值和叶绿素含量)，研究每个因素对鲜切莴笋保鲜效果的影响。本研究中每个处理组和对照组均重复3次。

(3)响应面试验。根据Box-Behnken响应面设计原理，以超声功率、超声时间、超声温度和ZnO NPs溶液浓度为4个变量，分别以鲜切莴笋的失重率、a*值和叶绿素含量作为响应值进行4因素3水平的中心组合试验，利用Design Expert 8.0.6软件分析数据，确定超声协同ZnO NPs保鲜方法的最佳工艺条件。响应面分析因素与水平设计如表1所示。

表1 Box-Behnken设计因素及水平表

(4)失重率的测定。失重率的测定采用差量法，分别记录各因素处理的样品第0、2、4、6、8 d的重量，用式(1)计算处理样品的失重率。

(1)

式中,M1为贮藏前重量；M2为贮藏后对应天数重量。

(5)感官评价的测定。参照王羽等[24]的研究，稍作修改。选取经过培训的10名食品专业本科生依据鲜切莴笋感官评价标准(见表2)对鲜切莴笋横切面的色泽、气味、硬度和品质进行综合感官评价。

(6)a*值的测定。采用色差仪测定a*值。选取鲜切莴笋样品横切面任意面积测定，重复3次，其中a*值正、负值分别表示偏红和偏绿。

(7)叶绿素含量的测定。参考余翔等[25]的方法，并稍做修改。称取0.2 g鲜切莴笋样品，放入盛有10 mL提取溶剂[V(80%丙酮)∶V(95%乙醇)=2∶1]的容量瓶中，封口，置于黑暗条件下浸提至莴笋呈无色时过滤出莴笋样品，用提取溶剂定容至25 mL后，于645 nm和663 nm波长处测定吸光度。将吸光度带入式(2)、(3)中计算叶绿素含量。

Ct=8.02A663 nm+20.01A645 nm,

(2)

(3)

式中,Ct为分光光度法计算出的叶绿素质量浓度(mg/L)；V为提取液体积(mL)；m为样品质量(g)。

表2 鲜切莴笋感官评价标准

1.4 数据处理

采用Sigmaplot 14.0作图，实验结果取3次测定平均值，利用SPSS 19.0软件对数据进行差异显著性检验、回归分析及相关性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

(1)超声功率对鲜切莴笋保鲜效果的影响。超声功率对鲜切莴笋品质指标的影响如图1所示。由图1可知，随着超声波功率的增加，鲜切莴笋的失重率和a*值随功率的增加呈先下降后上升的趋势，不同的超声功率处理组失重率均呈显著性差异(P<0.05)，而鲜切莴笋的感官评价和叶绿素含量则随着功率的增加呈先上升后下降趋势。第8 d时，300 W超声功率处理下的鲜切莴笋失重率最低，为(1.362±0.255)%，比对照组降低了36.77%。当超声功率大于300 W后，鲜切莴笋失重率反而比对照组更高。原因可能是随着超声功率增大，破坏了果蔬中部分水分子和水分子之间的氢键，从而加速了水分的流失[26]。相应的，300 W超声功率处理下的鲜切莴笋感官评价最高，叶绿素含量最高，a*值相较于其他处理组别也最好。因此，根据单因素实验结果结合实际生产的经济性，选择超声功率为200、300、400 W进行响应面优化试验为宜。

(2)超声时间对鲜切莴笋保鲜效果的影响。超声时间对鲜切莴笋各项品质指标的影响如图2所示。由图2可知，不同超声时间处理显著影响鲜切莴笋的保鲜效果，超声时间为10 min时失重率和a*值上升最为缓慢，第8 d时失重率相较于对照组降低了19.31%，而15 min和20 min的超声时间可能因为超声时间过长破坏了细胞膜的结构，导致其失水程度甚至高于对照组。莴笋经切割后感官评价呈现出整体下降的趋势，超声时间10 min作用下能更好地减少莴笋表面的腐败菌但较少破坏莴笋的组织结构，故感官评价达(19.00±1.00)分，相较于其他条件得分更高，是对照组的0.508倍。新鲜莴笋中叶绿素的含量为4.900 mg/100 g，低温贮藏8 d后超声10 min处理条件下的鲜切莴笋叶绿素含量最高，相较于其他处理条件更好地维持了色泽品质。因此，根据单因素实验结果结合实际生产的经济性，选择超声时间为5、10、15 min进行响应面优化试验为宜。

(3)超声温度对鲜切莴笋保鲜效果的影响。超声温度对鲜切莴笋各项品质指标的影响如图3所示。由图3可知，超声处理温度显著影响鲜切莴笋的保鲜品质。65 ℃处理时，处理组和对照组的a*值上升极为显著；25 ℃处理下较为显著；35 ℃和45 ℃处理时，处理组区别并不显著；但45 ℃处理下a*值上升最为缓慢，是对照组的2.136倍。鲜切莴笋在前6 d时，65 ℃处理时处理组较其他组感官评价下降最为迅速，在第8 d用45 ℃处理时，处理组感官评价为(19.333±2.517)分，是对照组的0.465倍。叶绿素含量在贮藏期间呈下降趋势，低温贮藏2 d后，45 ℃处理条件下叶绿素含量下降最慢，对照组下降最快。经过8 d低温贮藏后45 ℃处理条件下的鲜切莴笋叶绿素含量最高，为(2.519±0.039) mg/100 g，相较于其他处理条件更好地维持了色泽品质，这与上面有关色差的研究结果基本一致。因此，根据单因素实验结果结合实际生产的经济性，选择超声温度为35、45、55 ℃进行响应面优化试验为宜。

图1 超声功率对鲜切莴笋品质指标的影响

图2 超声时间对鲜切莴笋品质指标的影响

(4)不同浓度ZnO NPs处理对鲜切莴笋保鲜效果的影响。ZnO NPs溶液浓度对鲜切莴笋各项品质指标的影响如图4所示。由图4可知，随着ZnO NPs溶液浓度的增加，其鲜切莴笋失重率和a*值呈先下降后上升的趋势，且第8 d时ZnO NPs溶液浓度为0.07 g/L的失重率最低，为(2.553±0.037)%，比对照组降低0.366倍；a*值上升最为缓慢。感官评价和叶绿素含量均呈先上升后下降趋势，在第0 d时各处理组间差异性不大，均呈现出良好的感官品质，然而自第2 d起，对照组开始较其他组感官评价下降迅速，0.07 g/L的ZnO NPs溶液浓度感官评价下降最慢；新鲜莴笋0.07 g/L浓度条件下叶绿素含量下降最慢，经过8 d低温贮藏后叶绿素含量最高，为(3.718±0.096) mg/100 g,比对照组增加了49.25%，相较于其他处理条件更好地维持了色泽品质，这与上面有关色差的研究结果基本一致。因此，根据单因素实验结果结合实际生产的经济性，选择ZnO NPs溶液浓度为0.05、0.07、0.09 g/L进行响应面优化试验为宜。

图3 超声温度对鲜切莴笋品质指标的影响

图4 ZnO NPs溶液浓度对鲜切莴笋品质指标的影响

2.2 响应面试验结果

(1)响应面试验设计和结果。以超声功率(A)、超声时间(B)、超声温度(C)、ZnO NPs溶液浓度(D)为自变量，以失重率(Y1)、a*值(Y2)和叶绿素含量(Y3)作为响应值，利用Design Expert 8.0.6软件进行响应面试验，响应面试验设计及结果如表3、4所示，再对响应面结果进行多元回归拟合分析，分析结果如表5所示。

表3 超声协同ZnO NPs保鲜处理响应面实验设计

采用Design Expert 8.0.6软件对试验模型进行多元回归拟合，其失重率(Y1)与超声功率(A)、超声时间(B)、超声温度(C)和ZnO NPs浓度(D)的多元回归方程为

Y1=0.36+0.11A+0.37B+0.67C+0.14D+0.23AB+0.065AC+0.013AD+0.49BC+

0.50BD-0.038CD+0.17A2+0.36B2+1.35C2+0.33D2。

由表5可见，鲜切莴笋失重率的回归模型P值<0.01，说明该模型的回归方程有统计学意义。失拟项P值为0.172 2>0.05，说明失拟项无统计学意义，无失拟因素存在；模型的复相关系数R2=0.981 7，校正相关系数Adj.R2=0.963 4，说明该模型与实际情况拟合很好，实验误差小，对鲜切莴笋失重率的预测准确性高。在回归模型中，一次项B、C，交互项BC、BD和二次项B2、C2、D2有统计学意义(P<0.01)；一次项A、D，交互项AB和二次项A2有统计学意义(P<0.05)。由此表明各个试验因子与响应值之间的关系不是简单的线性关系。

表4 超声协同ZnO NPs保鲜处理响应面实验结果

采用Design Expert 8.0.6软件对试验模型进行多元回归拟合，其a*值(Y2)与超声功率(A)、超声时间(B)、超声温度(C)和ZnO NPs浓度(D)的多元回归方程为

Y2=-9.93-0.16A-1.75B-3.22C-0.093D-0.17AB+0.10AC+0.030AD-0.70BC+

0.070BD-0.50CD+1.88A2+2.63B2+3.09C2+1.87D2。

由表5可见，鲜切莴笋a*值的回归模型P值<0.01，说明该模型的回归方程有统计学意义。失拟项P值为0.077 8>0.05，说明失拟项无统计学意义，无失拟因素存在；模型的复相关系数R2=0.966 1，校正相关系数Adj.R2=0.932 2，说明模型的拟合程度较好，可用该回归方程对试验结果进行分析和预测。在回归模型中，一次项B、C和二次项A2、B2、C2、D2有统计学意义(P<0.01)。

采用Design Expert 8.0.6软件对试验模型进行多元回归拟合，其叶绿素含量(Y3)与超声功率(A)、超声时间(B)、超声温度(C)和ZnO NPs浓度(D)的多元回归方程为

Y3=0.77-8.333E-004A+3.333-003B+0.058C+6.667-003D+5.000-003AB-2.500

-003AC+0.010AD+0.060BC-0.020BD+0.030CD-0.093A2-0.12B2-0.087C2-0.16D2。

由表5可见，鲜切莴笋叶绿素含量的回归模型P值<0.01，说明该模型的回归方程有统计学意义。失拟项P值为0.978 8>0.05，说明失拟项无统计学意义，无失拟因素存在；模型的复相关系数R2=0.954 4，校正相关系数Adj.R2=0.908 8，说明该模型与实际情况拟合很好，实验误差小，对鲜切莴笋叶绿素含量的预测准确性高。在回归模型中，一次项C和二次项A2、B2、C2、D2有统计学意义(P<0.01)，交互项BC有统计学意义(P<0.05)。由此表明各试验因子与响应值之间的关系不是简单的线性关系。

表5 回归模型的方差分析

(2)失重率的响应面曲线分析及优化。鲜切莴笋中的水分和营养物质因为呼吸作用和蒸腾作用很容易被消耗，造成莴笋重量上的损失，这是鲜切莴笋失重的主要原因，同时水分流失也是导致果蔬萎蔫、变质及腐烂的重要原因，故而失重率是评价鲜切莴笋失水程度的重要指标之一，具有重要的实践意义。两因素相互作用影响超声协同ZnO NPs保鲜法失重率的响应曲面图及等高线图如图5所示。由图5可知，超声功率(A)和超声时间(B)的等高线偏圆形，响应面较为陡峭，说明AB间的交互作用对鲜切莴笋失重率的影响达到显著水平；超声时间(B)和超声温度(C)以及超声时间(B)和ZnO NPs浓度(D)的等高线呈现椭圆形，响应面更陡峭，说明BC间和BD间的交互作用非常显著，且BC和BD的交互效应对于鲜切莴笋失重率的影响程度较高。

图5 两因素相互作用影响超声协同ZnO NPs保鲜法失重率的响应曲面图及等高线图

(3)a*值的响应面曲线分析及优化。鲜切莴笋在贮藏过程中的褐变主要是多酚物质的氧化所导致的，当莴笋呈新鲜状态时，多酚与O2被区域化隔离，当对莴笋进行切割时，多酚与O2接触，从而发生反应产生红棕色醌，醌在植物体内可以发生自身聚合或与细胞内的氨基酸和蛋白质发生反应产生黑色或褐色的沉淀物。两因素相互作用影响超声协同ZnO NPs保鲜法a*值的响应曲面图及等高线图如图6所示。由图6可知，超声温度对鲜切莴笋a*值影响较大，可能与温度升高易破坏多酚氧化酶(PPO)活性有关。而超声温度、超声功率和ZnO NPs溶液浓度对鲜切莴笋a*值的影响不显著，表现为其响应面较为平缓。

图6 两因素相互作用影响超声协同ZnO NPs保鲜法a*值的响应曲面图及等高线图

(4)叶绿素含量的响应面曲线分析及优化。叶绿素含量是影响莴笋及其加工品色泽的重要因素，其在光照、高温等条件下易分解导致叶绿素含量的降低。两因素相互作用影响超声协同ZnO NPs保鲜法叶绿素含量的响应曲面图及等高线图如图7所示。由图7可知，超声时间(B)和超声温度(C)的等高线偏圆形，响应面较为陡峭，说明BC间的交互作用对鲜切莴笋叶绿素含量的影响达到显著水平。超声时间和超声温度对鲜切莴笋叶绿素含量影响较大，可能是由于温度过高加速了叶绿素的分解。

图7 两因素相互作用影响超声协同ZnO NPs保鲜法叶绿素含量的响应曲面图及等高线图

(5)各因素间的交互作用分析。响应面图可以评价实验因素对响应值的交互作用的大小，以确定最佳的水平范围。响应曲面的坡度越陡峭，则表明响应值对条件的改变越敏感，相反，如果响应面的坡度相对平缓，则表明鲜切莴笋可以忍受处理条件的改变，而不影响到响应值的大小。根据Design Expert 8.0.6软件对不同条件处理鲜切莴笋的最佳工艺参数回归方程拟合优化后，得到超声协同ZnO NPs处理鲜切莴笋保鲜的最佳工艺为超声功率297.21 W、超声时间10.50 min、超声温度46.47 ℃、ZnO NPs溶液浓度0.07 g/L。为方便实验，将最佳工艺优化后取为超声功率300 W、超声时间10 min、超声温度46 ℃、ZnO NPs溶液浓度0.07 g/L。在此条件下保鲜贮藏8 d的鲜切莴笋失重率为(0.23±0.002)%，比对照组降低0.245倍；a*值和叶绿素含量分别为(-9.98±0.19) mg/100 g和(1.340±0.044) mg/100 g，比对照组增加66.89%和51.64%。

3 结论

本试验研究不同超声功率、超声时间以及超声温度处理对鲜切莴笋保鲜效果的影响，并对最佳处理条件进行响应面优化，确定超声协同ZnO NPs保鲜方法的最佳配比。实验结果如下：①超声协同ZnO NPs处理鲜切莴笋的最佳工艺条件为超声功率300 W，超声时间10 min，超声温度46 ℃，ZnO NPs溶液浓度0.07 g/L，在此条件下鲜切莴笋保鲜效果较好，a*值和叶绿素含量分别可达-9.98和1.340 mg/100 g，贮藏8 d后的鲜切莴笋失重率可降低至0.23%；②超声协同ZnO NPs处理显著抑制鲜切莴笋失重率的上升，抑制茎部切口褐变，延迟腐烂的速度，减缓叶绿素的降解，能够较好地维持鲜切莴笋的感官品质。但超声功率过高会增大鲜切莴笋的失水速度，适宜功率的超声波处理随着时间的延长也会增大鲜切莴笋的失水率，超声温度升高有助于减少鲜切莴笋表面微生物，但温度升高到一定时，鲜切莴笋的失重率也会受到一定影响。温度和功率均会影响鲜切果蔬保鲜过程中SOD、POD、PPO和CAT等相关酶的活性，从而影响鲜切果蔬的贮藏品质。