PCR技术在食品微生物检测中的应用价值

张译芳 王圣瑜

本文主要探究PCR技术在食品微生物检测中的应用价值，以期能够为相关从业人员提供可借鉴的经验。首先阐述PCR技术的主要内涵和类型，并对PCR技术的具体应用方法进行总结，然后通过多重串联式实时荧光定量PCR检测方法，对样品基因组DNA进行提取，从而分析食品微生物情况。试验证明，PCR技术在食品微生物检验中具有良好的应用效果。

一、PCR技术的基本概述

PCR技术是指聚合反应链技术，利用模板在核苷酸底物和DNA聚合酶的共同作用下，扩增DNA数量，在食品安全检测中可以测定食品过敏源、食源微生物、乳品企业的阪崎肠杆菌等，应用前景十分广阔。具体而言，PCR技术可以分为常规PCR技术、实时荧光定量PCR技术和数字PCR技术这三种类型。

1.常规PCR技术。通过退火、变性、延伸，复制子链DNA，快速实现体外扩增的目的，仪器试剂成本较低。

2.荧光定量PCR技术。作为当前应用最广泛的食品微生物检测技术之一，荧光定量PCR技术是一种在DNA扩增反应中通过荧光化学物质测得每次聚合酶链式反应循环后产生总量的方法，利用内参或外参方法对待测样品中的DNA序列进行定量分析，通过荧光信号对PCR进程实时检测。在PCR扩增指数过程中，模板CT值与该模板的起始复制数存在线性关系，所以可以作为定量依据，并且此法较为成熟，操作简单，试剂成本中等，配套仪器和试剂均较为齐全，特异性也较强。

3.数字PCR技术。数字PCR技术可以直接读取DNA分子个数，是一种核酸分子绝对定量计数，利用专业检测设备（比如QX100dPCR），可以将扩增后的芯片转移至微滴阅读分析系统，之后读取荧光信号。整个过程在封闭的芯片中运行，操作较为复杂，但是污染的风险性较低，通过评估数字PCR平台以及平台之间相互验证，可以使测定结果更加精准。

二、PCR技术在食品微生物检测中的具体应用

在食品微生物检测中，PCR技术主要是利用微生物分子检测仪，对有害微生物的核酸进行提取，然后构建荧光定量PCR体系，通过多重串联式实时荧光定量PCR检测方法，对样品基因组DNA进行提取，从而分析食品微生物情况。具体应用方法如下：

1.选定检测仪器。在进行微生物检测之前，要选择合适的检测仪器，本文主要以CSY-ATP检测仪为例。CSY-ATP检测仪能够对水中微生物、食品中微生物、餐饮器具等进行快速检测，利用生物化学方法来检验ATP菌落总数，其检测精度为1*10-16molestp，檢测范围为1-9999PLUS，重复性≤5%。由于含有高灵敏度光度计，此检测方法较为便捷，不需要复杂的前期处理。利用微生物分子检测仪，可以测试果汁、豆浆、鸡肉、牛奶、面包、水产品等样本中的微生物含量;利用多孔板可以完成多次试验，检测出食品中含有的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠埃希菌、单核细胞增生李斯特氏菌等多种食源性疾病的主流微生物。技术人员也可以构建多重串联式实时荧光定量PCR检测方法，但是应用到的主要仪器设备除了CSY-ATP检测仪，还包括多重PCR试剂盒、立式压力蒸汽灭菌器、冰箱、凝胶成像仪、核酸电泳仪、梯度PCR仪、超微量分光光度计、光学显微镜等，检验过程需要在全封闭情况下进行，防止出现假阴性和假阳性情况，从而提高检测质量和准确性。

2.试验与检测方法。（1）配置试剂。①BHI肉汤：取鸡肉或者猪肉作为样本，称取38.5g，放置在1000mL蒸馏水中，加热搅拌使其溶解，在121℃高压环境下灭菌，灭菌时间为15-18min。②0.5*TBE：用灭菌纯水稀释50mL的10*TBE，放置在25℃环境中保存。③10*TBE：将108g的Ttis、55g的硼酸、0.5M的Na2EDTA（40mL）混入800mL蒸馏水中，对pH值进行调整，确保pH值能够稳定在7.8-8.0范围内，然后放置在高压灭菌室中保存。④2%琼脂糖凝胶：称取定量琼脂糖，每份0.9g，加入0.5*TBE，用量为30mL，放置于蓝盖瓶中，用微波炉加热1min，待琼脂糖全部溶解后，取出倒入模具冷却。⑤BHI琼脂：称取琼脂糖40g，将其溶解之后放入蒸馏水中分装，蒸馏水含量为1000mL，之后放入121℃高温环境下进行灭菌，灭菌时间设定为15-18min。

（2）构建PCR检测体系。对需要检测的靶基因进行扩增，将目标菌种制成模板，混合液含有每个菌种20ng，其多重PCR反应体系和PCR反应程序如表1所示。

在多重PCR反应体系和PCR反应程序构建完成之后，按照测定结果绘制标准曲线，得到扩增效率。根据稀释倍数的不同，确定菌落计数结果。每隔12h进行三重PCR检测，如果变异系数均维持在1.3%-3.9%，说明所采用的测试方法重复性良好，具有良好的精准性。

（3）试验操作。以PCR技术在检测牛奶中沙门氏菌含量的研究作为试验案例，选择合适的PCR模板制备方法，之后进行灵敏度试验，得出检测试样中沙门氏菌的敏感性。具体操作方法如下：

①样品选择和纯菌培养。选择市场中的普通牛奶产品（盒装，每盒250mL），经过高压蒸汽灭菌处理后放置在冰箱中保存，冷藏温度保持在4℃-5℃，全部试验菌株接种5mL液体，液体培养需要震荡，培养基为LB，培养温度为37℃-38℃，震荡速率为220r/min。采用乙醇沉淀法制备PCR模板，提取1mL细菌培养液离心2min，转速为12000r/min，置于小离心管中;采用灭菌蒸馏水洗涤，利用悬浮液缓冲，悬浮液为300μL，之后在8000r/min的环境下离心20min，隔水煮沸15min;加入40μL醋酸钠，pH值为5.4;加入无水乙醇80μL，在12000r/min的环境下离心20min，利用50μL的TE缓冲剂复溶;利用70%乙醇进行洗涤，放入4℃冰箱中冷却之后取出，即为模板。

②检测结果分析。以上述试验流程得到的样品DNA为模板，将具有一定浓度的菌液接种到试验样本中，提取样本中的基因组DNA，对扩增CT值进行绘图，检测MT-PCR。依据MT-PCR标准曲线，测定样本中MT-PCR的检测下限，其中阪崎肠杆菌的检测下限为103LOD（CFU/g）、大肠埃希菌的检测下限为103LOD（CFU/g）、蜡样芽孢杆菌的检测下限为103LOD（CFU/g）、金黄色葡萄球菌的检测下限为103LOD（CFU/g）、单核细胞增生李斯特氏菌的检测下限为102LOD（CFU/g）、福氏志贺氏菌的检测下限为103LOD（CFU/g）。观察R2值，若R2值符合标准值规定，说明样品微生物检测合格;若超过标准值，则说明样品微生物检测不合格，样品中存在微生物超标问题，不符合食品安全条例，这种食品如果被消费者食用，会给消费者的身体健康造成一定影响。

三、PCR技术在食品微生物检测中的应用价值

沙门氏菌是引起食源感染性腹泻的致病微生物之一，其菌型繁多，严重威胁消费者的安全和健康。传统的检测方法更依赖于微生物检测法或免疫荧光试验法，但却费时费力，并且可能存在假阳性、假阴性问题，不适于常规检查，如果利用PCR扩增技术则可以提高检测的准确性。

随着科学技术的发展，PCR技术已经成为分子检测领域的佼佼者，不仅在病源体检测方面具有一定的优势，在病源微生物检测方面的灵敏性也更高，对各种类型都可以进行检测，大大缩短了报告周期，与传统检测方法相比，操作更为简单。

由于不同微生物所需要的营养物质、温湿度、pH值均有不同，在微生物检测中需要耗费大量的人力和物力去观察革兰氏染色情况、菌落特征和细胞特征，自动化程度不高，无法满足现代食品微生物检测的需要。而利用PCR技术可以由一个人完成检测过程，一天就可以得出结果，还可以同时检测多种病原微生物，而传统微生物检测方法至少需要七天。

除了在牛奶中检测沙门氏菌，技术人员也可以按照相应的标准和操作流程，对其他微生物菌落进行检验，将其他菌体接种至液体培养基内，然后测定PCR技术在食品微生物检测方面的有效性，测定样品的偏差值。比如，将市面上某家超市中采集的牛奶、酱油、面包、鸡肉、饮料作为样本，测定其菌体含量，具体数据如表2所示。

通过表2的数据可以发现，采用PCR技术测定食品微生物含量，能够得到各种菌落的实际情况。例如，在牛奶检测过程中，其沙门氏菌的标准值为23.11%，金黄色葡萄球菌的标准值为20.80%，但在检测过程中，只有样品1和样品2的沙门氏菌含量在标准值之内，而样品3的沙门氏菌含量高于标准值，同时只有样品1的金黄色葡萄球菌在标准值范围之内，样品2和样品3的金黄色葡萄球菌均超于标准值。因此，若只将沙门氏菌和金黄色葡萄球菌两项微生物作为检验标准，仅有样品1符合食品安全规定。以此类推，可以判定食物微生物是否超标，也可以证明PCR技术能够更加方便、快捷、迅速地得出检验结论，提高检测质量和准确性。348D1141-19FB-420F-9ED2-A08157F8BE63