血液涂片制作教学改进的探讨

祁根兄，纪丽丽，张慧

摘要：准确识别血液中各种血细胞的形态、构造，并绘出各种血细胞的形态结构图，是动物医学专业大一学生在心血管系统这一章节中的实训技能课。针对此种情况，对血涂片的制作提出改进方法，尽可能减少实验失败的几率，从而提高学生的实习热情，把学生的注意力吸引到实验课上来。为圆满完成实验教学任务创造了必要条件。

关键词：动物医学专业;血涂片;制作;血细胞形态;识别

对于绝大多数动物医学专业的大一学生而言，血细胞形态学镜检的学习和实践较为困难，能将其学好、学精者为数不多，具体表现为学生相关理论知识欠缺，多数学生仅停留在单个血细胞的形态识别上，而欠缺利用血细胞形态学理论课上的内容对各种血细胞进行观察和总结，实习热情不高，因此为了激发兴趣、调动积极性并保证每个学生积极主动地投入实验，取得较满意的教学效果。血细胞形态学镜检是血液检验的重要内容，也是众多血液病的基础诊断技术，同时可为疾病疗效判断提供依据[1]。

1 采血

做血涂片所用血液可以提前采好，也可以现用现采，各有优、缺点，提前采好的优点是可以节约上课时间，缺点在于保存时间过长或温度不合适，会造成血细胞沉淀和凝集。现场采集的优点是血液比较新鲜，血细胞在血涂片上分布较均匀，不会造成血细胞的凝集现象。缺点是采血时出现学生之间推来推去或不敢采血的现象，有的同学还会导致采血失败，耽搁时间，影响实验顺利开展，实验准备时间会延长，导致课堂秩序混乱和学生注意力会出现分散现象。

2 血液取用

将血液滴加在载玻片上，此方法可采用载玻片的四个边角中的其中一个尖角蘸取血液[2]，但是蘸取血液的量一定要少，不能太多，若太多会导致血细胞大量堆积和重叠，最后致使无法观察而让实验失败。也不能太少，太少会导致图片上可供观察的血细胞太少。另外也可采用20μL微量移液管来移取血液，吸取5μL就够了，此法优点是血量的把控准确，缺点是微量移液管使用要熟练，微量移液管使用不熟练者会导致血量把控不准而影响血细胞的观察。

3 血液涂片

将血液涂布在载玻片上，此方法可以采取用载玻片1的边缘去推片或拉片的方法[3]。若用左手固定载玻片2，将血滴加在载玻片2右侧中央时，可以采用350倾斜使载玻片1先与血滴接触，等血滴沿载玻片1的边缘慢慢渗透并扩散开。然后将载玻片1匀速向载玻片2的左侧匀速推动，直到将血滴推完为止。这样血液就均匀涂布在载玻片2上了（如图1所示）。反之，若将血滴滴加在载玻片2的左侧中央时，可以采用350度倾斜，同样使载玻片1先与血滴接触，等血滴沿载玻片1的边缘慢慢渗透并扩散开。然后将载玻片1匀速向载玻片2的右侧拉动直到将血滴拉完为止，这样血液就均匀涂布在载玻片2上了。此操作过程中等待血液沿载玻片1边缘扩散，这一现象非常重要（如图2所示）。若不等血滴扩散就推片或拉片，就会造成血细胞堆积和重叠现象。若速度控制不好，会导致血膜涂布不均匀，有的区域有，有的区域无的斑马线现象，而致使显微镜下无法观察血细胞。

4 干燥

将血液涂布在载玻片2上面后，涂片制成后，应在空气中快速摇动或扇干，将血膜干燥并固定附着在载玻片上，防止细胞皱缩变形或因空气潮湿而溶血。

5 染色

采用瑞氏-姬母萨染色法[4]，瑞氏-姬姆萨染液由珠海贝索生物技术有限公司生产，瑞氏-姬姆萨染液试剂由瑞氏-姬姆萨染液（A液），磷酸盐缓冲液（pH 6.8）（B液）组成，在pH值为6.8的缓冲液中，血液中的大多数蛋白质均达到或接近自己的等电点，因而能很好地吸附相应的染料而着色。

瑞氏-姬姆萨染色液是利用Romanowsky Stain技术原理改良而成的。细胞的着色过程是染料透入被染物并存留其内部的一种过程，此过程既有物理吸附作用，又有化学亲和作用。各种细胞及细胞的各种成分由于其化学性质不同，对瑞氏-姬姆萨染色液中的酸性染料（曙红）和碱性染料（亚甲蓝）的亲和力也不一样。因此，标本涂片经瑞氏-姬姆萨染色液染色后，相应各类细胞呈现不同的着色，从而达到辨别其形态特征的目的。大一新生第一次接触到，应向他们说明它包括嗜酸性染料和嗜碱性染料两部分，因此染色后，细胞中嗜酸性物质呈红色，嗜碱性物质呈蓝色，嗜中性物质呈紫红色，这对正确理解血涂片上不同种类血细胞呈现不同颜色有较好的帮助。

染色方法：滴加A液约0.5～0.8mL于涂片上，染色1min;再将B液滴加于A液上（滴加量为A液的2～3倍），以洗耳球吹出微风使液面产生涟漪状，使两液充分混合，染色4～10min。切记不要使染液蒸发干，若染色时间过长或染液蒸发干，就会导致染料附着太严重，而无论怎么水洗都洗不干净。

另外，染色时间需视何种标本、涂片厚薄、有核细胞多少、何种细胞及室温等而定;气温较低时，可适当延长染色时间。染色结果如出现嗜酸性粒细胞变碱，则考虑是否染色时间太长所致。染液量需充足，勿使染液蒸发干燥，以防染料沉着于涂片上。做血细胞染色时，当天气寒冷或湿度较大时，应于37℃温箱中保温促干，以免细胞变形缩小或在染色时脱片。染液若被装载于染色机上使用，B液的开封使用时间不宜过长，以免因管路和空气污染出现絮状沉淀。染色的好坏固然与涂片的好坏有关，但染料的质量、缓冲液的pH值及染色时间等对其也有重要的影响，而缓冲液的pH值对血涂片染色的影响常被忽视。

6 水洗

水洗（冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲去，以防有沉渣沉淀在标本上），水洗时水流要细小，沿玻片2的边缘缓慢冲洗，不能用大水流正对血膜直冲，这样会导致血膜冲落。水洗1～2min后要在显微镜下观察一下水洗的效果，若没洗干净，再继续水洗，水洗过程中要勤观察，直到洗干净为止，不然有可能会导致洗不干净或冲洗时间过长而导致颜色变淡。

7 镜检

等水洗完成后，用吸水紙吸掉玻片2上的水分，注意不要擦拭，以免擦掉血膜。将吸掉水分的玻片2置于显微镜载物台上进行镜检。红细胞呈粉红色，白细胞浆中颗粒清楚，并显示出各种细胞特有的色彩，细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。白细胞形态上与血细胞涂片的白细胞相同，一般白细胞的多寡，提示发炎程度的高低，对医师的诊断具有一定的指标作用[5]。血细胞的染色、白细胞中的特殊颗粒均显示清晰，红细胞内的血红蛋白染成桔红色[6]，中性粒细胞颗粒染成蓝紫至紫红色，嗜酸性粒细胞颗粒染成鲜红色，嗜碱性粒细胞颗粒染成深紫蓝色，淋巴细胞核染成深蓝紫色，胞质染成天蓝色。单核细胞核染成浅紫色，胞质染成灰蓝色[7]。

总之，采血、血液取用、涂片、干燥、染色、水洗等过程每一步都至关重要，稍有疏忽，就会全盘皆输。因此每一步都要严格把握，不可粗心大意，更不能急于求成。以确保实验过程顺利进行，力求制作出清晰、好辨认、标准的血液涂片。

参考文献：

[1] 方向，蒋婧.血液涂片细胞形态学联合全自动血细胞分析仪在血常规检验中的应用价值分析[J].黑龙江医学，2021，45（23）：2549-2551.

[2] 南京农学院.家畜生理学实验指导[M].北京：农业出版社，1982：62-63.

[3] 周其虎.动物解剖生理[M].第3版.北京：中国农业出版社，2019.

[4] 董常生.家畜解剖学[M].第3版.北京：中国农业出版社，2001.

[5] 丁静，黄世霜，胡延生.骨髓涂片、印片与切片检查在基层医院诊断血液疾病中的应用[J].福建医药杂志，2020，42（3）：172-174.

[6] 刘春亮.血涂片分析在血常规检验中的应用[J].中国医药指南，2021，19（18）：89-90.

[7] 郑秀诗.血涂片染色方法的研究进展知多少[J].家庭生活指南，2019（5）：159.