慢性丙肝患者血清半乳糖凝集素-4 和白细胞介素-27 的表达变化分析

许海波，江罗佳，吴锦瑜

（江西省九江市第一人民医院1.肝病科；2.肾内科，九江 332000）

丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus ，HCV）感染是一种常见感染性疾病，全世界有超过1.775 亿患者[1]。 丙型肝炎病毒感染可发展为肝硬化和肝细胞癌， 迫切需要有效的早期抗病毒药物来阻止不良预后的发生[2]。 根据免疫和病毒之间的平衡寻找标志物或可用于判断患者预后的结局。 半乳糖凝集素是一类聚糖结合蛋白或凝集素，可识别细胞表面大量N-乙酰乳糖胺残基[3-4]。 其中半乳糖凝集素-4（GAL4）在控制肠道炎症和促进肠道炎症方面具有双重作用[5]。 此外，在乙型肝炎病毒感染患者中观察到其显著升高， 表明其可能参与了肝脏炎症反应[6]。 免疫调节性的细胞因子可影响HCV 慢性感染的进展和肝损伤程度。 其中， 白细胞介素-27（IL-27） 是活化的抗原呈递细胞释放的白细胞介素-6/白细胞介素-12 家族细胞因子之一[7]。 据报道，IL-27 在病毒感染中具有抗病毒和抗炎作用。但目前关于GAL4 和IL-27 是否在慢性丙肝患者中存在异常，是否与患者病毒载量存在关联，并不清楚。 据此， 本研究将通过分析丙肝患者血清GAL4 和IL-27 的变化及其与临床资料间的关系，找出丙肝疾病严重程度新型生物标志物。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2016 年5 月至2021 年3 月间于本院肝病科就诊的慢性丙肝患者39 例为本研究的疾病组。 纳入患者均为HCV RNA 和Anti-HCV 抗体阳性， 排除合并其他类型肝炎病毒感染的患者或伴有终末期肝病如失代偿肝硬化、 肝衰竭和肝癌等患者。 排除采样前接受过抗病毒治疗或免疫治疗的患者。 同时选取30 例同期性别和年龄匹配的健康人作为本研究的对照组。

1.2 方法 采集治疗前的外周血液样本6 mL。其中3 mL 于干燥管中， 室温放置15 min，4000 rpm 20 min 离心分离血清，置于-80 ℃中保存备用，保存备用的标本应不超过2 年，采用同样的试剂盒分3次检测。用于酶联免疫吸附试验测定血清GAL4 和IL-27 的浓度。 另3 mL 于EDTA 抗凝管中， 用于PBMC 的提取（天津灏洋Ficoll 淋巴细胞分离液）。使用商业化的实时荧光定量PCR 检测试剂盒（达安基因）对HCV RNA 进行定量检测，检测下限为2 log10 copies /mL。血清生化标志物使用日立7600全自动生化分析仪及配套试剂完成测定。 血清GAL4 和IL-27 的浓度采用Abcam 公司的GAL4酶联免疫试剂盒（ab213785）和IL-27 酶联免疫试剂盒（ab83695）加以测定，所有步骤严格参照试剂盒说明书执行。 PBMC 的提取及GAL4 和IL-27 的mRNA 水平测定：EDTA 抗凝全血与等体积PBS 混匀， 缓缓加入淋巴细胞分离液， 密度梯度离心（2000 rpm，30 min），收集中间层细胞即为PBMC。E.Z.N.A. Total RNA Kit II 提取PBMC RNA；Prime-Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 合成cDNA；SYBR@ Premix Ex TaqTM II 用 于Real time qPCR 反应， 所有实验严格按照试剂盒说明书执行。 Real time qPCR 扩增程序：预变性95 ℃30 s，变性95 ℃5 s，循环数为40，退火60 ℃30 s。选取GAPDH 为内参基因， 利用2-△△Ct法计 算Tim-3 mRNA 和Gal-9 mRNA 的相对含量。 引物序列，见表1。

表1 GAL4 和IL-27 的引物序列

1.3 统计学处理 统计学软件SPSS 23.0 对本研究中的数据进行分析，数据用（±s）表示，两组间差异采用独立样本t 检验比较。 GAL4 和IL-27 与临床参数间的相关性行Spearman 相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性HCV 感染患者一般资料 分析发现，慢性HCV 感染者具有更高水平的ALT、AST 和ALP， 与健康对照组间的差异均具有统计学意义（P<0.05）；而相比对照组，HCV 感染者具有更低水平的PLT 和ALB（P<0.05）。此外，两组人群间WBC并无显著差异（P>0.05）。

2.2 慢性HCV 感染患者血清GAL4 和IL-27 及PBMC 中GAL4 mRNA 和IL-27 mRNA 对于血清游离的蛋白水平，ELISA 结果发现慢性HCV 感染患者血清GAL4 和IL-27 均显著高于健康对照组人群， 差异具有统计学意义 （P<0.05）。 而对于PBMC 中GAL4 和IL-27 mRNA 水平， 荧光定量PCR 结果同样发现慢性HCV 感染患者PBMC 中GAL4 和IL-27 mRNA 水平均显著高于健康对照组人群，差异有统计学意义（P<0.05）。 见图1。

图1 慢性HCV 感染患者与健康对照组的GAL4 和IL-27 的表达变化

表2 慢性HCV 感染者与健康对照组的一般资料

2.3 GAL4 和IL-27 与临床指标间的相关性分析分析发现血清GAL4 与AST 和HCV RNA 均呈显著负相关性；GAL4 mRNA 与AST 和HCV RNA 呈显著负相关性， 而与ALB 呈显著正相关性。 血清IL-27 与HCV RNA 呈显著负相关性，而与ALB 呈显著正相关性；IL-27 mRNA 同样与HCV RNA 呈显著负相关性，而与ALB 呈显著正相关性。 见表3。

表3 GAL4 和IL-27 与临床指标间的相关性分析

3 讨论

丙型肝炎是全球公共卫生问题之一。 使用利巴韦林的旧治疗方案， 超过一半的治疗患者用peg-IFN-α 不能持续清除病毒或避免慢性病毒感染的长期并发症现象的发生[8]。 在慢性丙型肝炎中， 宿主免疫因素以及可促进免疫系统失调的HCV 相关蛋白的生物学效应构成了HCV 相关肝炎的免疫发病机制[9]。 从失衡的免疫系统中寻找某些异常表达的蛋白可能为发掘丙型肝炎患者疾病严重程度的生物标志物提供新的思路。 本研究旨在评估丙型肝炎患者血清GAL4 和IL-27 表达水平及其与病毒载量的相关性。 结果表明，与对照组相比， 丙型肝炎病毒组患者GAL4 的mRNA 表达水平和血清蛋白水平均显著升高。 这可能是机体对肝脏炎症所产生的反应，因为GAL4 具备独特的抗炎特性。 据报道，GAL4 在肠道炎症性疾病中可通过与活化的T 细胞表面CD3 结合， 进而增强T细胞凋亡或减少促炎细胞因子的分泌[10]。 然而，GAL4 是否在肝脏炎症中发挥类似的抗炎机制需要进一步研究。 此外，在丙型肝炎病毒组中GAL4相对mRNA 表达水平和血清蛋白水平均与病毒载量之间存在高度负相关。这一发现表明GAL4 对丙型肝炎病毒可能具有抵抗作用， 这与其他种类的半乳糖凝集素在其他病毒感染中显著上调的结果类似。 这些半乳糖凝集素可通过激活和增强免疫反应来进行抗病毒防御[11]。 如半乳糖凝集素-3 通过不同的机制在丙型肝炎病毒感染中产生抗病毒作用。 半乳糖凝集素-3 抑制丙型肝炎病毒对白细胞介素-6 的促炎反应，减少慢性炎症[12]。 此外，半乳糖凝集素-3 还可以作为丙型肝炎肝硬化的预后标志[13]。 相反，半乳糖凝集素-9 却可维持慢性丙型肝炎病毒感染， 其可通过诱导丙型肝炎病毒特异性T 细胞凋亡和增加抑制性Treg 细胞数量而抑制适应性免疫[14]。 当前研究表明GAL4 在丙型肝炎病毒感染中具有抗病毒作用， 但需要进一步的研究来探索其在抗丙肝病毒作用中的具体机制。 Cai 等[6]在HBV 感染患者中报告了类似的结果。 该研究认为GAL4 可减少促炎细胞因子分泌、诱导T 细胞凋亡来对抗肝脏炎症的免疫反应。同样，Kondoh 等[15]的研究显示，与对照组相比，肝硬化丙型肝炎患者肝组织中GAL4 基因表达增加， 但仍低于HCC患者。

此外，本研究还显示，与对照组相比，丙型肝炎病毒感染患者IL-27 水平也显著升高，其与病毒载量之间同样存在高度显著的负相关性， 这些发现与Houssen 等的结果类似。该研究认为这些结果可能是因为IL-27 的抗病毒活性，IL-27 可以诱导一些抗病毒STAT1 依赖性基因， 并具有类似于干扰素-α 一样的抗肝病毒感染的作用[16]。 因此，IL-27 与病毒载量呈现显著负相关性， 其可能在丙型肝炎患者中发挥抗HCV 病毒效应，也可能成为反应患者病毒载量的新型生物标志物。 当前研究发现以前关于IL-27 的研究结果或可用IL-27 对T细胞和肝细胞的作用来解释，即IL-27 诱导抗病毒Th1 细胞的合成； 此外，IL-27 与干扰素-α 通过诱导STAT1 依赖性基因阻断Th17 细胞和iTreg 细胞分化具有相似的抗病毒机制[19]。 IL-27 可诱导STAT1 依赖途径和STAT3 依赖途径， 这两种途径均与病毒感染和肝脏病毒感染的HCC 进展有关，表明IL-27 可能作为病毒性肝炎的新型治疗靶点[20]。未来的研究中将进一步评价IL-27 对丙肝病毒复制的影响及其对疾病结局的影响。

总之， 本研究初步证实在慢性丙肝患者中GAL4 和IL-27 均显著升高，且与丙肝病毒载量密切相关，可能为慢性丙肝提供新的生物标志物。