不同当归补血制剂对膜性肾病大鼠肾功能影响的实验研究

李 晶，王一强，张玉香，史晓伟，姜 蕾，姜德民*

（1.甘肃卫生职业学院，甘肃 兰州 730207；2.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000）

膜性肾病（Membranous Nephropathy，MN）是成人肾病综合征的主要原因，本病起病隐匿，早期症状不明显，随病程发展，可出现大量蛋白尿、高度水肿、低蛋白血症、高血压、高脂血症、肾功能损伤等临床表现[1]。该病发病率逐年递增，严重影响患者的工作和生活质量，还有向终末期肾功能衰竭和尿毒症转归的危险，给患者带来巨大的压力[2-3]。近年来，中医药治疗MN的研究取得了令人瞩目的进展，中医学认为，MN属本虚标实证，以脾肾气虚为本，水湿、湿热、瘀血为标，治当益肾健脾培其本，并辅活血利水、清利湿热、摄精固涩、祛风通络、搜风剔络等法以治其标[4-6]。有研究表明，黄芪当归合剂能促进肝脏蛋白质合成，提高血浆蛋白水平，改善蛋白质代谢紊乱[7]。当归补血汤取于李东垣的《内外伤辨惑论》，其中介绍黄芪，味甘，性微温，归脾肺经，可补气健脾，益卫固表，利尿消肿；当归，味甘辛，性温，归肝、心、脾经，可补血调经，活血止痛，两药合用有气血双补之效，可用于MN中肾气亏虚兼气血（阴）虚者[8]。本实验研究通过不同当归补血制剂干预MN大鼠，进一步说明不同当归补血制剂对MN大鼠治疗效果的影响。

1 实验材料

1.1 动物

选取SPF级别，同批雄性SD大鼠150只，清洁级，体质量（150±20）g，购自甘肃中医药大学实验动物中心，生产许可证号:SYXK（甘）2011-0001。其中，140只大鼠为实验用大鼠，10只大鼠为备用大鼠。实验前将动物置于室内适应环境1周，室温18℃～20℃，标准大鼠饲料喂养，自由进食，饮用自来水。

1.2 药物

本研究使用药物包括当归补血汤中药煎剂（黄芪30 g、当归6 g），由甘肃中医药大学药学实验室制备；当归补血口服液（郑州市协和制药厂，批号:012003041）；当归补血丸（商丘市金马药业有限公司，批号:20062012）；当归补血颗粒配方（甘肃中医药大学附属医院购买）。

1.3 试剂

血清总胆固醇（TC）试剂盒、甘油三酯（TG）试剂盒（上海朝瑞生物科技有限公司）、血清总蛋白（TP）试剂盒（保定长城临床试剂有限公司）；牛血清白蛋白（C-BSA）、弗氏不完全佐剂（美国Sigma-Aldrich公司）、血肌酐（CRE）测定试剂盒、血尿素氮（BUN）测试盒（上海科华生物工程股份有限公司）等。

1.4 仪器

HH-S型数显恒温水浴箱（江苏省金坛市医疗仪器厂）；5417R低温高速离心机（德国EPPENDORF公司）；ZY KHB-1280型全自动生化分析仪（上海科华生物工程股份有限公司）。

2 实验方法

2.1 动物分组与造模

将140只SD大鼠按照随机数字表法分为14组，每组10只:空白组，模型组，当归补血汤煎剂低、中、高剂量组（以下分别简称:煎剂低剂量组、煎剂中剂量组、煎剂高剂量组），当归补血口服液低、中、高剂量组（以下分别简称:口服液低剂量组、口服液中剂量组、口服液高剂量组），当归补血丸低、中、高剂量组（以下分别简称:丸剂低剂量组、丸剂中剂量组、丸剂高剂量组），当归补血颗粒配方低、中、高剂量组（以下分别简称:颗粒低剂量组、颗粒中剂量组、颗粒高剂量组）。常规饲养7 d后，测其24 h UTP均在正常范围。将1 mg C-BSA加入0.5 mL磷酸盐缓冲液PBS（pH为7.4）中配制成溶液，然后与同等量的弗氏不完全佐剂混匀，使其充分乳化。除空白组外，模型组和给药组大鼠的背部、双侧腹股沟及腋下做多点皮下注射进行预免疫（隔日一次），一周3次。预免疫1周后，开始正式免疫，即模型组和给药组每只大鼠隔日一次尾静脉注射C-BSA 16 mg/kg（注射前用1 mL PBS配成溶液），每周注射3次，连续注射4周[2，9]。空白组及模型组给予生理盐水，每日灌胃一次，连续4周，于实验前（0 d）和制模后 6、12、18、24、30 d 测量体重，并根据体重调整给药量。

2.2 给药方法

造模结束后，各组进行灌胃治疗。参照《药理实验方法学》[2]，大鼠的给药量为黄芪2.5 g/kg、当归0.5 g/kg。药物组低剂量组给予黄芪1.25 g/kg、当归0.25 g/kg，中剂量组给予黄芪2.5 g/kg、当归0.5 g/kg，高剂量组给予黄芪5 g/kg、当归1 g/kg。使用时，用蒸馏水将不同当归补血制剂配成小剂量组黄芪0.062 5 g/mL、当归0.012 5 g/mL，中剂量组黄芪0.125 g/mL、当归0.025 g/mL，大剂量组黄芪0.250 g/mL、当归0.05 g/mL的溶液。空白组与模型组分别给予生理盐水，给药组分别给予不同浓度的不同当归补血制剂溶液，灌胃量为4 mL/d，1次/d，各组连续给药4周。

2.3 标本采集与指标检测

本研究通过观察不同当归补血制剂对MN大鼠24 h尿蛋白定量（UTP）、血清总蛋白（TP）、血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血肌酐（CRE）和血尿素氮（BUN）水平，阐述不同剂型对MN大鼠的治疗作用。

2.3.1 标本采集 实验各组大鼠分别于造模前、造模后0周、给药2周后、给药4周后放入代谢笼中，收集24 h尿液。给药4周后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，暴露腹腔，腹主动脉取血，离心10 min后分出血清，检测生化指标。

2.3.2 指标检测 采用双缩脲法测定大鼠24 h UTP，全自动生化分析仪检测大鼠血清UTP、TC、TG、TP、CRE和BUN水平。

2.4 统计学方法

数据采用SPSS20.0软件包进行统计学处理，计量资料用（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对MN大鼠一般状况的影响

空白组大鼠精神状态佳，反应灵敏，进食及饮水量正常，毛发有光泽。造模后，与空白组比较，模型组大鼠精神萎靡，反应迟钝，活动及进食、饮水减少，毛发光泽减弱甚至脱落，尿量增多，大便稀溏，部分大鼠出现腹部皮下水肿。灌胃治疗后，与模型组相比，不同剂型当归补血制剂组大鼠的精神状态、活动、饮食、饮水、毛发脱落、大便等情况均有好转。

3.2 对MN大鼠24 h尿蛋白定量的影响

实验结果显示，空白组、模型组和各给药组造模前的 24 h UTP值之间无统计学差异（P＞0.05）。造模后，模型组和各给药组与空白组比较，24 h UTP明显增加（P＜0.05）。给药后各给药组与模型组比较，24 h UTP明显下降（P＜0.05），但仍高于空白组（P＜0.05）。给药治疗2周后，颗粒中、低剂量组，口服液中、低剂量组的24 h UTP高于煎剂高剂量组（P＜0.05）。给药治疗4周后，颗粒低剂量组，口服液中、低剂量组的24 h UTP仍高于煎剂高剂量组（P＜0.05）。见表1。

表1 不同当归补血制剂对MN大鼠24 h UTP的影响（±s，mg/24 h）

表1 不同当归补血制剂对MN大鼠24 h UTP的影响（±s，mg/24 h）

注:与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与煎剂高剂量组比较，ΔP＜0.05

组别n 造模前 造模后0周 给药后2周 给药后4周空白组模型组煎剂高剂量组煎剂中剂量组煎剂低剂量组口服液高剂量组口服液中剂量组口服液低剂量组丸剂高剂量组丸剂中剂量组丸剂低剂量组颗粒高剂量组颗粒中剂量组颗粒低剂量组10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 6.50±0.83 6.60±0.91 6.60±0.79 6.60±0.65 6.50±0.89 6.70±0.31 6.60±0.87 6.60±0.77 6.50±0.98 6.70±0.41 6.70±0.28 6.60±0.67 6.60±0.59 6.50±0.94 76.50±0.51 42.30±0.78*48.80±0.97*39.60±0.88*39.90±0.79*41.10±0.12*41.60±0.31*42.10±0.89*40.60±0.87*40.90±0.66*41.10±0.91*40.80±0.79*41.20±0.71*41.80±0.43*77.60±1.65 59.20±20.89*26.90±10.77*#28.10±10.91*#30.30±11.56*#31.40±0.15*#35.30±11.10*#Δ 36.10±10.89*#Δ 27.70±10.65*#28.10±10.81*#30.50±12.13*#29.20±10.10*#33.80±11.99*#Δ 34.20±12.34*#Δ 77.20±1.78 64.60±23.05*20.70±7.11*#22.20±6.43*#25.10±4.64*#24.40±8.17*#25.80±8.31*#Δ 26.30±7.78*#Δ 20.90±6.70*#21.40±6.33*#25.20±5.67*#22.50±6.81*#23.70±6.75*#25.70±7.66*#Δ

3.3 对MN大鼠血清TP、TC及TG水平的影响

实验数据表明，经过4周的治疗后，与空白组比较，模型组，颗粒低剂量组和口服液中、低剂量组大鼠的TP水平显著降低（P＜0.05），TC和TG 水平显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，不同剂型当归补血制剂组大鼠血清TP水平均有不同程度的升高，TC和TG水平均有不同程度的降低。其中，煎剂高、中、低剂量组，丸剂高、中、低剂量组，颗粒高剂量组和口服液高剂量组的血清TP水平显著升高（P＜0.05），TC和TG水平显著降低（P＜0.05）。与煎剂高剂量组比较，颗粒低剂量组和口服液中、低剂量组的TP水平显著降低（P＜0.05），TC和TG水平显著升高（P＜0.05）。见表2。

表2 不同当归补血制剂对MN大鼠血清TP、TC和TG的影响（±s）

表2 不同当归补血制剂对MN大鼠血清TP、TC和TG的影响（±s）

注:与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与煎剂高剂量组比较，ΔP＜0.05

组别n TP（g/dL）TC（mmol/L）TG（mmol/L）空白组模型组煎剂高剂量组煎剂中剂量组煎剂低剂量组口服液高剂量组口服液中剂量组口服液低剂量组丸剂高剂量组丸剂中剂量组丸剂低剂量组颗粒高剂量组颗粒中剂量组颗粒低剂量组10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 41.57±2.83#32.75±1.40*39.89±2.49#38.71±1.83#37.56±1.54#37.86±1.45#35.41±1.02*Δ 34.69±0.86*Δ 39.24±1.22#38.01±0.78#36.94±1.07#38.11±1.15#36.53±0.64 35.22±0.73*Δ 1.43±0.34#1.84±0.38*1.59±0.41#1.61±0.21#1.68±0.33#1.70±0.22#1.72±0.18*Δ 1.75±0.41*Δ 1.63±0.35#1.69±0.15#1.70±0.28#1.67±0.14#1.70±0.21 1.74±0.35*Δ 0.86±0.13#1.49±0.53*0.94±0.27#1.06±0.43#1.14±0.37#1.17±0.36#1.22±0.57*Δ 1.25±0.49*Δ 0.98±0.25#1.10±0.41#1.16±0.45#1.11±0.33#1.19±0.51 1.23±0.47*Δ

综上所述，在不同当归补血制剂中，煎剂高、中、低剂量组，丸剂高、中、低剂量组，颗粒高剂量组和口服液高剂量组对改善MN大鼠血清TP、TC和TG水平具有一定疗效。

3.4 对MN大鼠血清BUN和CRE水平的影响

结果显示，各组间BUN水平无统计学差异（P＞0.05）。CRE水平:与空白组比较，模型组，颗粒低剂量组和口服液中、低剂量组更低（P＜0.05）；与模型组比较，煎剂中、高剂量组，丸剂中、高剂量组，颗粒高剂量组和口服液高剂量组的CRE水平更高（P＜0.05）；与煎剂高剂量组比较，颗粒低剂量组和口服液中、低剂量组CRE水平更低（P＜0.05），但各组水平均在正常值范围。见表3。

表3 不同当归补血制剂对MN大鼠血清BUN和CRE的影响（±s）

表3 不同当归补血制剂对MN大鼠血清BUN和CRE的影响（±s）

注:与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与煎剂高剂量组比较，ΔP＜0.05

组别n BUN（mmol/L）CRE（μmol/L）空白组模型组煎剂高剂量组煎剂中剂量组煎剂低剂量组口服液高剂量组口服液中剂量组口服液低剂量组丸剂高剂量组丸剂中剂量组丸剂低剂量组颗粒高剂量组颗粒中剂量组颗粒低剂量组10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 7.86±0.63 7.04±0.51 7.69±1.29 7.60±0.45 7.58±0.54 7.56±0.37 7.50±0.44 7.48±0.51 7.63±0.72 7.58±0.27 7.53±0.33 7.60±0.84 7.57±0.81 7.50±0.55 50.08±3.79 40.10±4.85*47.71±4.81#46.74±4.53#44.43±3.88 46.12±3.94#43.82±4.33*Δ 42.15±4.67*Δ 47.11±3.94#46.23±3.71#44.00±4.13 46.46±4.62#44.87±4.55 43.39±3.78*Δ

4 讨论

4.1 对MN大鼠24 h尿蛋白定量的影响

蛋白尿是MN大鼠的主要临床表现，是影响本病治疗的重要因素之一。本实验研究发现，经不同当归补血制剂干预治疗后的MN大鼠的24 h UTP有不同程度的下降，说明不同当归补血制剂可降低MN大鼠的尿蛋白，且实验结果表明，使用当归补血煎剂与丸剂比较，MN大鼠24 h尿蛋白量下降差异不明显，但使用这两者均明显低于使用颗粒剂和口服液的24 h尿蛋白量。

4.2 对MN大鼠血清TP、TC及TG水平的影响

大量的蛋白随尿液排出，导致血浆中蛋白减少，血浆胶体渗透压降低，出现水肿现象。而血浆中蛋白降低，出现低蛋白血症时可诱发肝脏合成胆固醇、甘油三酯增多，导致血脂升高。该实验研究中，经不同当归补血制剂干预治疗后的MN大鼠的TP水平有不同程度的升高，TC和TG水平均有不同程度的降低，说明不同当归补血制剂可以提高血清总蛋白，调节血脂，减少MN并发症的发生。本实验也显示，使用当归补血煎剂与丸剂比较，MN大鼠的TP水平、TC和TG水平差异不明显，但使用这两者的TP水平均明显高于使用颗粒剂和口服液，TC和TG水平均明显低于使用颗粒剂和口服液。

4.3 对MN大鼠血清BUN和CRE水平的影响

当肾脏受损时，肾小球滤过膜结构和功能受到破坏，进而影响肾小球的滤过功能。本实验研究显示，经不同当归补血制剂干预治疗后，MN大鼠的血清CRE水平均有不同程度的升高，可有效改善肾小球的滤过功能，实验数据表明，使用当归补血煎剂与丸剂对MN大鼠血清BUN和CRE水平的影响差异不明显，但使用这两者均明显高于使用颗粒剂和口服液的血清CRE水平。

综上可知，不同当归补血制剂均有治疗MN的作用，但当归补血汤煎剂和丸剂的治疗效果优于当归补血颗粒配方和口服液。