西红花花瓣中槲皮素与山奈素含量测定研究

张慧芳龚雪媛陈宗良周婷婷陈依琳

(1.金华职业技术学院医学院，浙江 金华 321007；2.金华食品药品检验检测研究院，浙江 金华 321000)

西红花来源为鸢尾科植物番红花(Crocus sativus L.)的干燥柱头，具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神之功效[1]。现代药理学研究表明，西红花具有强身健体的功效。2020版《中国药典》规定西红花的药用部位为柱头。由于西红花柱头仅占整朵花重量的7.4%，故其产量极低。为获得1kg的柱头，需采摘约17万朵花[2]，同时生成的去柱头西红花约13kg[3]。实地调查发现，采摘了柱头的西红花花瓣除一部分作为餐桌时令菜及畜禽饲料外，其余大部分都是作为废弃物丢弃，这是对资源的极大浪费。已有学者从西红花花瓣中分离得到类黄酮、皂苷、总黄酮、多糖等物质[4,5]，黄酮类成分是西红花非药用部位尤其是花瓣的主要成分，主要有山柰素及其糖苷类、槲皮素及其糖苷、花色苷类、类异鼠李素及其糖苷等[6,7]。黄酮类化合物在植物界中分布广泛，除了抗心脑血管疾病、抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒作用外，还有抗肿瘤、保肝、降脂、抗肺纤维化等多种生理活性，受到国内外的高度重视[8-10]。查阅文献，发现较少见到对西红花花瓣中黄酮类化合物含量测定的相关报道，本试验采用RP-HPLC法同时测定西红花花瓣中槲皮素、山奈素2种黄酮类成分含量，为西红花花瓣质量控制方法制订提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

试验材料为西红花干燥花瓣，采自寿仙谷药业，由金华职业技术学院技术学院医学院陈坚波副主任中药师鉴定，为鸢尾科植物番红花(Crocussativus L.)的花瓣。取材时间为2021年11月23日。

1.2 仪器与试剂

Aglient1260-Ⅱ型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；XS105Du电子天平，十万分之一，瑞士Mettler公司。

槲皮素对照品(批号：100081-201610，纯度99.1%)，山奈素对照品(批号：110861-202013，纯度93.2%)，均自中国食品药品检定研究院购置；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Aglient Eclipse XDB-C18柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液(49∶51)；检测波长为370nm。流速为1mL·min-1；进样量为10μL。

2.2 对照品溶液制备

取槲皮素、山奈素对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1mL含槲皮素25.901μg，含山奈素218.72μg的混合溶液，即得对照品溶液。放入冰箱中，4℃保存备用。

2.3 供试品溶液制备

精密称取西红花花瓣细粉(过40目筛)0.5g，置具塞锥形瓶中精密称定，加甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)的混合溶液25mL，摇匀，置水浴中加热回流30min，待冷却至室温后，转移至50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 保留时间的确定

将山奈素、槲皮素混合对照品溶液按2.1项色谱条件进样分析，得到对照品及样品色谱图，见图1。

图1 西红花花瓣样品高效液相色谱图

由图1可知，西红花花瓣供试品出现与混合对照品中山奈素(21.313min)、槲皮素(11.486min)保留时间一致的2个峰。

2.5 标准曲线线性范围考察

精密吸取山奈素和槲皮素混合对照品溶液1μL、2μL、5μL、10μL、15μL和20μL进样，按2.1色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标(Y)，对照品浓度为横坐标(X)，计算线性回归方程。

槲皮素标准曲线的回归方程：

Y=4245.9X+2.2102(r=0.9999)

山奈素标准曲线的回归方程：

Y=3719.8X+14.476(r=0.9999)

结果表明，槲皮素在0.025～0.50μg、山奈素在0.218～4.36μg与所测得的峰面积呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验

精密吸取2.3项下制备的西红花花瓣供试品溶液，每次10μL，连续进样6次，测定槲皮素和山奈素色谱的平均峰面积，槲皮素含量RSD=0.70%，山奈素含量RSD=0.63%。

2.7 重复性试验

取西红花花瓣粉约1g，精密称定，按2.3步骤平行制备供试品溶液6份，按2.1色谱条件分别进样10μL，记录槲皮素和山奈素色谱图。计算得到槲皮素和山奈素的平均含量分别为2.06μg·g-1，21.34μg·g-1，槲皮素含量RSD=1.26%，山奈素含量RSD=0.87%。说明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h，按2.1色谱条件进样，记录色谱图，得到峰面积值。计算槲皮素含量RSD=1.71%，山奈素含量RSD=1.78%。表明室温放置的供试品溶液在12h内稳定。

2.9 回收率试验

称取含量已知的西红花花瓣粉约0.25g(槲皮素含量0.212%，山奈素含量2.134%)，精密称定，共6份，精密加入槲皮素和山奈素对照品适量，按2.3步骤制备供试品溶液，在2.1色谱条件下进行测定，记录色谱图，得到峰面积值，计算回收率，结果如表1所示。

表1 回收率测定

槲皮素的回收率平均为92.5%，RSD=1.28%(n=6)；山奈素的回收率平均为101.53%，RSD=1.14%(n=6)。表明上述方法的回收率符合要求，准确度良好。

2.10 样品含量测定

按照2.3制备供试品溶液，在2.1色谱条件下，测定5份西红花花瓣样品中槲皮素、山奈素含量，计算槲皮素、山奈素的平均含量。结果见表2。

表2 西红花花瓣样品中槲皮素、山奈素含量

3 结果与分析

西红花花瓣以黄酮类、酚酸类为主，此外，还有皂苷、生物碱和蒽醌等成分。西红花花瓣中所含的黄酮类成分和类胡萝卜素成分，尤其是山奈素糖苷和西红花苷，具有良好的抗氧化能力，可开发为抗氧化产品。此外，西红花花瓣中槲皮素等黄酮类成分具有较强的抗络氨酸酶活性[6]。西红花瓣具有良好的抗氧化活性，具有较好的开发前景，但与此相关的含量测定指标较少见诸报道。虽然在西红花的非药用部位中也检测到了用来评价西红花药用部位(柱头)质量的指标成分，如藏红花苦素、西红花苷和藏红花醛等，但含量较低，不利于质量控制。为保证其临床治疗效果，需寻求有效检测方法以控制其质量。

试验发现，西红花花瓣样品不经水解，测得的槲皮素和山奈素的含量普遍较低，这是因为槲皮素和山奈素在西红花花瓣中多以苷的形式存在[6]。且山奈素、槲皮素都含有酚羟基，显弱酸性，所以需用盐酸水解的方法来提取。在对提取溶剂优化时发现，供试品提取溶液与浓盐酸比例达到4∶1时，提取液中的槲皮素和山奈素即可完全水解，因此，本试验采用向20mL供试品提取液中加入5mL浓盐酸，即甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)，作为提取溶剂提取西红花花瓣样品。流动相则选择了甲醇-0.4%磷酸系统，因为这一系统对槲皮素与山奈素有较好的分离效果且峰形较好，而乙腈-0.4%磷酸和甲醇-0.2%磷酸作为流动相系统时，不能同时满足峰形好且2种成分与杂质峰能很好分离的要求，故没有选用。检测波长则选择了370nm，因为在此波长下，槲皮素、山奈素均具有很好的吸收图谱，且干扰小，分离效果好。

综上所述，西红花花瓣所含的黄酮类成分具有显著的药理作用，但目前较少见到对其黄酮类成分，尤其是同时测定多种黄酮类成分含量的报道。故本试验建立的RP-HPLC法同时测定西红花花瓣中槲皮素、山奈素的含量，对评价西红花花瓣的质量具有参考意义，为西红花花瓣的进一步开发利用提供了理论依据。