肉桂酸钾及其他三种防腐剂对大肠杆菌的抑菌作用分析

许春芳，余春平

（武汉能迈科实业有限公司，湖北 武汉 430000）

0 引言

肉桂酸又名桂皮酸、3 -苯丙烯酸，是中药肉桂的有效活性成分。肉桂酸具有良好的抑菌、抗肿瘤、消炎等活性，被广泛应用于食品、医药等行业中[1-2]。肉桂酸几乎不溶于水，实际应用时常使用钾盐，即肉桂酸钾。肉桂酸钾在饲料、水果保鲜、护肤品等领域已得到广泛的应用，研究发现给大鼠长期喂饲肉桂酸钾，不会出现肝脏蓄积中毒，也无胚胎毒性表现[3]。肉桂酸钾LD50远小于苯甲酸钠，安全性明显比苯甲酸钠高[4]。肉桂酸钾对细菌、黑曲霉、青霉、单核细胞李斯特菌等有较好的抑菌效果[5]。此外，肉桂酸钾还有较好的抗氧化能力，对酪氨酸酶有极好的抑制能力，能减少黑色素的生成[6-7]。以大肠杆菌为供试菌种，得出了肉桂酸钾及其他3 种食品防腐剂对大肠杆菌的抑菌率，并绘制大肠杆菌的生长曲线。以期为肉桂酸钾的防腐应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

大肠杆菌（CMCC（B）44103）；牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉、平板计数琼脂培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司提供；75%酒精、95%酒精，武汉兴和达商贸有限公司提供；氢氧化钠、氯化钠，天津市天力化学试剂有限公司提供；苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢乙酸钠，河南万邦化工科技有限公司提供；肉桂酸钾，武汉能迈科实业有限公司提供。

BBS-DDC 型超净工作台，济南欧莱博科学仪器有限公司产品；DGL-35B 型高压蒸汽灭菌锅，上海力辰仪器科技有限公司产品；UV752N 型紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司产品；FA1004 型电子天平，上海力辰仪器科技有限公司产品；DHP-360 型恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器有限公司产品；SZ-93 型自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂产品。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的活化培养

配制牛肉膏蛋白胨液体培养基，于121 ℃下高温高压灭菌15 min。无菌操作条件下用75% 酒精擦拭大肠杆菌安瓿瓶，打开安瓿瓶。吸取0.5 mL 液体培养基到安瓿瓶里，充分溶解后。将菌液全部吸出转入装有培养基的试管中，混合均匀将试管放入36 ℃培养箱中培养18～24 h。

配制牛肉膏蛋白胨固体培养基，于121 ℃下高温高压灭菌15 min。无菌操作下将培养基注入试管中，制成斜面。用接种环挑取上述步骤培养后的菌液一环，划线接种到试管斜面上。将试管放入36 ℃培养箱中培养18～24 h。

培养好的一部分试管斜面放入4 ℃冰箱中保存，即为保存菌种。用接种环挑取菌苔至牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基上，划线接种。放入培养箱中培养24 h，即为工作菌种。

1.2.2 菌悬液的制备

配制0.85%生理盐水、牛肉膏蛋白胨液体培养基，于121 ℃下高温高压灭菌15 min。无菌操作下取适量工作菌种溶解于100 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基数中，混合均匀，得大肠杆菌菌悬液。

菌悬液的浓度采用平板计数法计算。配制平板计数琼脂培养基，于121 ℃下高温高压灭菌15 min。无菌操作下将上述配制的菌悬液用无菌生理盐水稀释至1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6CFU/mL，取1×10-4，1×10-5，1×10-6CFU/mL 3 个浓度的菌悬液及无菌生理盐水各1 mL 至培养皿中，每个浓度2 个平行，加入15～20 mL 平板计数琼脂培养基，混合均匀，冷却凝固后将培养皿倒置放入37 ℃培养箱中培养48 h。计算菌悬液的浓度。

1.2.3 防腐剂溶液的配制

用生理盐水配制40 g/kg 苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢乙酸钠、肉桂酸钾溶液；并将4 种防腐剂用生理盐水逐级稀释至20.0，10.0，5.0，2.5 g/kg。于121 ℃下高温灭菌15 min，备用。

1.2.4 抑菌活性的测定

配制牛肉膏蛋白胨液体培养基、0.85%生理盐水，于121 ℃下高温灭菌15 min，备用。在无菌条件下向含有8.9 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中，试验组加入1 mL 防腐剂溶液、0.1 mL 菌悬液；阳性对照组用无菌水取代防腐剂，阴性对照组用牛肉膏蛋白胨液体培养基取代菌液（用于调零）。所有试管中的培养液总体积均为10 mL，使各防腐剂的终质量浓度分别为4.00，2.00，1.00，0.50，0.25 g/kg。将体系充分混匀后于37 ℃条件下培养24 h。

于波长560 nm 处，用阴性对照组培养液调零，检测样品培养液的吸光度，换算抑菌率：

1.2.5 大肠杆菌生长曲线的测定

取若干250 mL 锥形瓶，各加入44 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基，分别加入1 mL 菌悬液、5 mL 40 g/kg 肉桂酸钾溶液，分别编号为0，1.5，3.0，4.0，6.0，8.0，10.0 h。40 g/kg 苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢乙酸钠操作方法同上。同时，用无菌水代替防腐剂做阳性对照，用牛肉膏蛋白胨液体培养基取代菌悬液做阴性对照（空白调零）。最终各防腐剂的质量浓度均为4 g/kg。将体系充分混合后于37 ℃下振荡培养，按对应时间将培养液取出，立刻放入4 ℃冰箱中储存，待所有培养液培养结束后一同测OD 值。

在波长600 nm 处，用阴性对照培养液调零，检测培养液的吸光度，对含不同防腐剂不同培养时间的培养液从0 h 起开始测定，记录OD600值。

2 结果与分析

配制的菌悬液经平板计数法测得浓度为5×106CFU/mL。

不同浓度肉桂酸钾对大肠杆菌抑菌作用见图1。

图1 不同浓度肉桂酸钾对大肠杆菌抑菌作用

由图1 可知，质量浓度为0.25～4.00 g/kg 时，4 种防腐剂对大肠杆菌的抑菌作用随着浓度的增大抑菌率逐渐增加，表明4 种防腐剂对大肠杆菌均有一定程度的抑制作用。对大肠杆菌的抑菌能力大小为肉桂酸钾＞脱氢乙酸钠＞山梨酸钾＞苯甲酸钠。当质量浓度为4 g/kg 时，4 种防腐剂的抑菌率依次为85.09%±0.79%，78.03%±1.89%，66.39%±2.51%，58.2%±0.58%。结果表明，肉桂酸钾对大肠杆菌的抑菌作用强过其他3 种防腐剂，是一种潜力较大的抑菌剂。肉桂酸钾做为肉桂酸的钾盐，带有肉桂香气，通常被当作食品香精香料来使用。近年来，肉桂酸钾的防腐能力被越来越多的人所了解，在食品、饲料工业中也多有应用，如酱腌菜、饮料、休闲食品等。作为一种新型的香料型防腐剂，肉桂酸钾用在食品中，既起到调节食品气味的作用，也起到抑菌防腐的功效，即用最少的量就可以满足多种功效。

绘制大肠杆菌分别在浓度为4 g/kg 肉桂酸钾，4 g/kg 脱氢乙酸钠，4 g/kg 山梨酸钾，4 g/kg 脱氢乙酸钠作用下10 h 内的生长曲线，并与不加任何防腐剂（即生理盐水）的生长曲线比较。

大肠杆菌在4 g/kg 防腐剂作用下的生长曲线见图2。

图2 大肠杆菌在4 g/kg 防腐剂作用下的生长曲线

由图2 可知，大肠杆菌在前2 h 内生长缓慢，从第2 个小时开始，生长速度逐渐加快。与不加任何防腐剂的菌液相比，加4 种防腐剂中的任意一种防腐剂的菌液生长速度都会减慢，只是随着所加防腐剂的不同，减慢的程度不同、到达生长平台期的时间也不同。对大肠杆菌生长速度影响大小为肉桂酸钾＞脱氢乙酸钠＞山梨酸钾＞苯甲酸钠，肉桂酸钾对大肠杆菌的生长速度影响最显著。

3 结论

通过检测肉桂酸钾及其他3 种防腐剂对大肠杆菌的抑菌率、绘制大肠杆菌的生长曲线，从而确定了4 种防腐剂对大肠杆菌抑制能力大小为肉桂酸钾＞脱氢乙酸钠＞山梨酸钾＞苯甲酸钠。当质量浓度为4 g/kg 时，肉桂酸钾、脱氢乙酸钠、苯甲酸钠、山梨酸钾对大肠杆菌的抑菌率依次为85.09%±0.79%，78.03%±1.89%，66.39%±2.51%，58.2%±0.58%，肉桂酸钾对大肠杆菌的生长速度影响最显著，强过其他3 种传统的食品防腐剂。为肉桂酸钾的抑菌性能提供试验依据，进一步证实了肉桂酸钾有较强的抑菌能力，是一种潜力巨大、安全高效的食品防腐剂，可以广泛地应用于食品工业中。