血清HER2蛋白化学发光免疫检测方法的建立及评价

王娟，程华，胡琛光，林斯，于飞，刘涛，刘朋朋

(1.河北农业大学 河北野生动物健康研究中心，河北 保定 071000；2.河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071000；3.河北省科学院 生物研究所，河北 石家庄 050081；4.北京华科泰生物技术股份有限公司，北京 101111；5.天津华科泰生物技术有限公司,天津 300405)

乳腺癌已居女性恶性肿瘤之首，统计数据显示2018年全球女性乳腺癌新发病例达210万例，约占女性肿瘤的25%，且发病趋向年轻化，严重威胁女性生命健康[1-3].人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)基因也被称为ERBB2，是位于人体17号染色体长臂上的原癌基因，编码分子质量为185 ku的跨膜蛋白，定位于细胞膜表面，由胞外配体结合结构域、跨膜结构域和胞内蛋白酪氨酸激酶结构域3部分构成，其可与EGFR、HER3结合形成异源二聚体或与自身结合形成同源二聚体，导致胞内酪氨酸激酶结构域自身磷酸化，激活下游PI3K/AKT、RAS/RAF、JAK/STAT3等信号通路，抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞的增殖和迁移.HER2阳性乳腺癌占所有类型乳腺癌的15%～20%，且其恶性程度更高，预后更差[4-6].因此HER2是乳腺癌患者重要的预后指标，也是抗HER2药物治疗的主要预测指标.

目前，免疫组织化学(IHC)和荧光原位杂交(FISH)技术是评价乳腺癌患者HER2表达的主要手段，然而对于乳腺癌HER2阳性患者的病程和治疗效果动态监控亟需开发更为简便的方法[7].研究发现60.46%乳腺癌患者血清和组织HER2表达结果一致，提示血清HER2测定和组织学测定结果一致性较高，具有临床应用价值[8-9].HER2蛋白胞外区(extracellular domain，ECD)通过基质金属蛋白酶的作用脱落进入血液，即血清HER2 ECD，可通过免疫测定的方法进行定量检测，因此血清HER2 ECD值可能作为检测癌细胞复发和转移以预测治疗反应的潜在生物标志物[10-12].本研究建立了血清HER2蛋白磁微粒化学发光免疫检测法，并对其性能和已上市的西门子公司生产的同类型试剂盒的等效性进行了评价，以期为临床应用提供科学参考.

1 材料和方法

1.1 材料及样本来源

HER2抗体、抗原由河北省科学院生物研究所制备；标记有链霉亲和素(SA)的超顺磁性磁微粒、牛血清白蛋白(BSA)以及碱性磷酸酶(AP)购自罗氏诊断产品(上海)有限公司；4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸-N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)及酯化生物素(B)来自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸钠、碳酸氢钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等购自国药集团化学试剂北京有限公司；发光底物、洗涤液及磁微粒化学发光免疫分析仪(SAVANT-2020)由北京华科泰生物技术股份有限公司提供.乳腺癌患者及健康查体样本于2021年1月至12月收集于华北煤炭总医院，共100例.

1.2 检测方法建立

1.2.1 校准品的配制

采用牛血清稀释液将HER2抗原稀释至300、100、30、10、3、0 ng/mL，标记为S5～S0，2～8 ℃保存.

1.2.2 生物素标记抗体的制备

取包被抗体1 mg(该抗体经Protein A亲和纯化，纯度>95%)，放入0.05 mol/L碳酸缓冲液透析30 min后与1 mg酯化生物素室温搅拌1 h，随后将其置于磷酸缓冲液透析过夜.按照体积比1∶1 000，用含质量分数为1% BSA的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液配制试剂R1.

1.2.3 碱性磷酸酶标记抗体

取标记抗体1 mg(该抗体经Protein A亲和纯化，纯度>95%)，放入0.05 mol/L碳酸缓冲液透析30 min，随后采用SMCC常规标记方案进行AP的偶联.最终按照体积比1∶3000的比例用含质量分数为1% BSA的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液配制试剂R2.

1.2.4 磁微粒的配制

按照磁微粒供应商提供的操作指南，配制0.7 mg/mL的磁微粒试剂，标注为M.

1.3 性能及等效性分析

1.3.1 标准曲线的建立

采用西门子医学诊断产品HER2蛋白测定试剂盒(化学发光法)为企业标准品赋值，随后用制备的试剂进行测定并绘制4参数方程

其中，A为曲线上渐近线估值；D为曲线下渐近线估值；C为最大结合一半时对应的剂量；B为曲线的斜率.

1.3.2 空白限(limit of blank,LoB)评价

参照CLSI EP17-A2:2018(US)《Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation;Approved Guideline》，建立厂家试剂盒LoB.LoB由空白样本结果确定，设置Ⅰ类错误水平α和Ⅱ类错误水平β为5%，利用质量浓度为0的校准品进行重复性研究(n=180).取3个批次试剂分别对5个0值校准品重复检测，每天重复检测2次，连续检测6 d.若空白值呈正态分布，则LoB=μB+1.645 σB,其中，μB和σB分别为空白样品检测的均值和标准差.若空白值呈非正态分布，则LoB为第95百分位数(PctB)值，即0.95×Bn+0.5位置的结果.其中Bn为检测的重复次数.

1.3.3 外源性干扰

参照CLSI EP07-A2:2018(US)《Interference Testing in Clinical Chemistry;Approved Guideline》进行实验.分别在10、100 ng/mL HER2的模拟血清样本中添加顺铂、环磷酰胺、盐酸阿霉素、依托泊苷、甲氨蝶呤等药物，计算模拟样本的回收率，检测其潜在干扰性.

1.3.4 内源性干扰

参照CLSI EP07-A2:2018(US)《Interference Testing in Clinical Chemistry;Approved Guideline》进行实验.分别在10、100 ng/mL HER2的模拟血清样本中添加结合胆红素、未结合胆红素、甘油三酯、血红蛋白、胆固醇等干扰物质，计算模拟样本的回收率，检测其潜在干扰性.

1.3.5 精密度

参照CLSI EP05-A3:2014(US)《Evaluation of Precision of Quantitative Measurement Methods;Approved Guideline》进行实验.拟采用5×5的精密度验证方案，利用单因素方差分析试剂精密度.

1.3.6 回收率

取300 ng/mL的HER2标准品，加入到质量浓度接近于5 ng/mL的阴性样本中且标准品和阴性样本的体积比不大于1∶9，重复测定3次，取平均值并计算回收率.

1.3.7 分析特异性

分析特异性实验参照 CLSI EP07-A2:2018(US)《Interference Testing in Clinical Chemistry;Approved Guideline》进行，分析人表皮生长因子受体(EGFR 或HER1)与该试剂的交叉反应率.

1.3.8 稳定性

将成品试剂盒置于2～8 ℃条件下保存，期间以12、24、36、48、60周为周期，将回收实验、批内重复性、LoB作为验收条件，根据结果判断试剂盒稳定性.

1.3.9 一致性评价

采用本研究制备的试剂盒与西门子医学HER2蛋白测定试剂盒(化学发光法)平行检测100例临床样本，拟用Passing-Bablok回归进行相关性分析，采用Bland-Altman对样本偏倚进行分析，对本研究制备的试剂盒与市场已有产品进行一致性评价.

2 结果

2.1 标准曲线

将样本的质量浓度作为横坐标，检测发光值作为纵坐标，用4参数方程拟合绘制标准曲线，曲线方程为

相关系数r为0.999 6，表明发光值和校准品质量浓度在0～300 ng/mL里具有很好的相关性(图1).

图1 磁微粒化学发光法检测HER2蛋白标准曲线Fig.1 Standard curve of the magnetic particles chemiluminescence immunoassay detection of HER2 protein

2.2 LoB

采用IBM SPSS Statistics 25中Kolmogorov-Smirnov和Shapiro-Wilk检验法对空白样本检测结果进行正态性检验，鉴于样本量小于5 000，则按照Shapiro-Wilk检验结果呈非正态分布(P<0.05)，使用非参数法计算LoB.第95百分位数(PctB)值为180×(95/100)+0.5=171.5，即LoB=X171+0.5(X172-X171)，X171与X172是第171和第172的观测值.对180个检测结果由小到大进行排序，得到X171=0.48 ng/mL，X172=0.48 ng/mL，即空白限LoB=0.48 ng/mL(表1).

表1 LoB正态性检验Tab.1 LoB normal test

2.3 外源性干扰

在10 ng/mL和100 ng/mL HER2的模拟血清样本中添加表2药物，平均回收率<5%，表明该试剂具有很好的抗药物干扰能力.

表2 外源性干扰Tab.2 Exogenous interference

2.4 内源性干扰

在10 ng/mL和100 ng/mL HER2的模拟血清样本中添加表3内源性物质，平均回收率<5%，表明该试剂同时具有很好的抗内源性干扰能力.

表3 内源性干扰Tab.3 Endogenous interference

2.5 精密度

对HER2质量浓度为10 ng/mL和100 ng/mL的质控品L/H以及质量浓度约为14 ng/mL和70 ng/mL混合血清样本S1/S2进行检测，结果如表4所示，批间与批内CV均小于8%，证明该试剂有较高的精密度.

表4 精密度分析Tab.4 Accuracy analysis

2.6 回收率

回收率结果为98.21%，在90%～110%内符合预期标准.

2.7 分析特异性

与质量浓度最大为10 000 ng/mL的人皮生长因子受体(EGFR或HER1)交叉反应率为0.05%，可以忽略不计.

2.8 稳定性

稳定性测试结果如表5所示，在60周内HER2试剂的回收率、空白限和重复性均满足性能指标，证明该试剂具有较好的稳定性，在规定的储存条件下有效期大于48周.

表5 稳定性验证Tab.5 Stability verification

2.9 等效性评价

分别应用本研究建立的HER2/neu诊断方法与西门子公司生产的ADVIA Centaur HER2诊断试剂盒对来自于临床的100个样本进行检测，相关性和偏倚性分析结果显示，相关系数r=0.995，样本平均偏倚为-0.2 ng/mL(图2，3),证明所开发试剂与西门子公司生产的HER2检测试剂盒检测结果具有很好的一致性.

ρ1.SAVANT测定值；ρ2.ADVIA Centaur测定值.图2 HER2蛋白结果相关性分析Fig.2 Correlation analysis of HER2 protein

ρ.ADVIA Centaur和SAVANT测定均值.图3 HER2蛋白结果偏倚分析Fig.3 Bias analysis of HER2 protein

3 讨论

血清肿瘤标志物是罹患肿瘤时存在于机体血液中的糖类、酶类以及激素等多种类型的特异性反应产物，正常情况下机体血液中无表达或仅有少量表达，发生肿瘤时血液含量明显升高，因此血液中肿瘤标志物的种类和含量对于肿瘤的早期筛查、诊断以及肿瘤的预后跟踪监测和复发转移具有重要意义[2,13].

研究发现，HER2基因在15%～20%的乳腺癌细胞中过表达，而且HER2阳性乳腺癌患者恶性程度更高，预后更差[14].目前基于组织学方法的HER2检测方法有IHC和FISH等，然而对于HER2阳性乳腺癌患者的病程和治疗效果动态监控亟需开发更为简便的方法[7,15].研究人员对乳腺癌患者治疗前后和不同分期的血清和组织样本进行回顾性研究，发现早期乳腺癌患者血清HER2均为阴性，血清HER2升高或降低超过20%不仅与疾病进展有关，而且与治疗效果有关[8,16].对不同分期原发性乳腺癌患者血清和组织样本研究，发现血清HER2水平与肿瘤组织中HER2胞内段/胞外段高度一致，提示临床上通过检测肿瘤病人血清中的HER2蛋白水平作为肿瘤诊断以及治疗方案制定的标准是具有科学依据的，其变化趋势可作为肿瘤患者预后的评估指标[17-20].此外，检测血清中HER2蛋白水平可以避免组织活检对患者的伤害，同时对复发性或转移性的肿瘤进行动态监测以辅助判断疾病进程或治疗效果.

为了开展试剂的研发工作，本研究首先建立了HER2蛋白试剂盒的检测方法.在生物素标记抗体的制备中，本课题组对所使用的抗体经Protein A和Westorn blot方法进行了鉴定，并对检测条件进行工艺筛选.此外，该试剂盒从检测方法的建立到分析性能评估、等效性分析均符合国家药监局的要求，并参考了大量的CLSI文件.检测结果显示本试剂盒准确度、重复性良好，且在线性范围0～300 ng/mL内，相关系数r均不低于0.990 0，线性范围广，灵敏度高，且与西门子公司生产的HER2检测试剂盒检测结果具有很好的一致性.表皮生长因子受体家族包括4个成员：HER1受体、HER2受体、HER3受体和HER4受体，为了评估该试剂盒的特异性，测定了与质量浓度最大为10 000 ng/mL的人表皮生长因子受体(EGFR或HER1)的交叉反应率，结果为0.05%，表明该试剂盒的特异性良好.

本研究开发的试剂盒采用目前市面上主流的磁微粒化学发光法，与进口厂家进行试剂一致性分析，均具有较好的相关性，且该试剂盒结合全自动化学发光分析仪，可实现样本的随到随检，可降低总的检测成本.

综合以上评估，本试剂盒具有检测时间短、操作简便、自动化程度高、重复性和准确度高、特异性好等特点，应用和推广前景巨大，但尚需收集相关临床数据以评估其临床效能，为进一步优化血清HER2蛋白检测提供参考，为提升乳腺癌的诊疗效果提供技术支撑.