BpmiR156 过表达白桦株系的获得及扦插生根研究

李思雨 李玉杰 李新貌 彭 鑫 马 庆 申婷婷 李慧玉

（东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040）

microRNA（miRNA）是一类长度约20～24 bp的小分子非编码RNA，最早于1993 年在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）体内发现[1]。2002年Reinhart 等在拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗和花中首次发现了16 个植物miRNA[2]，随后，在植物中大量miRNA 家族陆续被挖掘，对于miRNA的功能研究也越来越深入。在植物中，这类RNA主要通过对其下游的靶基因剪切降解来参与调控植物根、茎、叶等营养器官及生殖器官的发育；并在低温、干旱、盐、重金属等非生物胁迫及生物胁迫中发挥重要作用[3−8]。

miR156是具有高度保守性的miRNA，其在蕨类、苔藓类植物、单子叶植物及双子叶植物中均有分布[9]。miR156是目前唯一已知的能感知年龄的miRNA，作为年龄的一种响应因子，随着植物年龄的增长，其表达含量逐渐下降，在玉米（Zea mays）[10]、水稻（Oryza sativa）[11]中都有相同表达趋势。同时miR156的含量也决定了植物的生理学年龄，在拟南芥中，过量表达miR156的植株表现为童期延长、开花延迟的特点[12]；在转基因加拿大杨（Populus × canadensis）中，过表达miR156株系靶基因表达降低，幼年期显著延长[13]。miR156通过调控其靶基因SPL家族转录因子以miR156/SPL模式参与调节植物的成花转变、叶子发育、分枝、次生产物代谢过程、果实成熟及非生物胁迫应答等过程[12,14]。

白桦（Betula platyphylla）是我国东北地区蓄积量最大的乡土速生阔叶树种，也是天然次生林更替的先锋树种。我国白桦良种选育工作始于“八五”期间，获得了一批省级及国家级良种。很多科研团队也开展了白桦扦插繁殖技术研究，但插穗生根难的问题仍未得到解决，制约了白桦良种化推广进程。基于此，本研究利用Gateway 技术构建了白桦miR156过表达载体，并成功获得了转miR156过表达白桦株系，通过研究转基因株系扦插不定根生根率及不定根发生过程中的解剖结构，探究miR156过量表达对白桦扦插生根的影响。本研究将为突破白桦扦插生根难的瓶颈提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 BpmiR156 基因克隆

根据白桦基因组及转录组数据（https://genomevolution.org/CoGe/GenomeInfo.pl?gid=35080），设计克隆基因特异引物：miR156−F（5′−CACCGTTTCCACATCTGGGAATAAGC−3′）和miR156−R（5′−TCAGCAGCTGTTGAAGTTGAAGG−3′），以白桦的cDNA 作为模板，扩增包含BpmiR156成熟序列的254 bp 的片段，反应体系为20 μL，包含：2 μL 10×KOD Buffer、2 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、1.2 μL MgSO4、0.3 μL KOD Plus Neo、0.6 μLmiR156−F （10 μmol/L）、0.6 μLmiR156−R（10 μmol/L）、2 μL 模板和11.3 μL 无菌水组成。反应程序为94 ℃预变性2 min 后，进行PCR 循环：94 ℃变性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，35 个循环后继续在72 ℃延伸7 min。

1.2 BpmiR156 植物过表达载体的构建及遗传转化

纯化后的PCR 产物通过TOPO 反应连接到入门载体（pENTRTM/D−TOPO Cloning Kit,invitrogen）上，转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞（购于宝生物工程（大连）有限公司），挑取单克隆进行PCR 检测（方法同1.1，用菌液做模板），将阳性克隆进行测序。提取上述TOPO 反应后经检测的阳性单克隆的质粒，进行LR 反应，将TOPO重组质粒连接至pGWB2 载体上。将重组质粒pGWB2−BpmiR156通过电击转化法导入到EHA105农杆菌感受态细胞中，在固体LB（含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L 利福平）培养基上进行筛选，获得带有重组质粒并具有卡那霉素抗性和利福平抗性的根瘤农杆菌，作为侵染植物用的工程菌。通过农杆菌介导的白桦合子胚转化法进行白桦的遗传转化[15]。

1.3 转BpmiR156 白桦的PCR 检测

通过改良的CTAB 法提取转基因白桦总DNA，以提取的转基因及非转基因对照白桦株系的DNA 为模板，以pGWB2−miR156为阳性对照，非转基因白桦（WT）为阴性对照，分别以基因序列设计上游引物（miR156−F：5′−CACCCATCTGGGAATAAGC−3'），以载体序列设计下游引物（pGWB2−R：5′−ACCACGTCTTCAAAGCAAGTGG−3′）进行PCR 扩增反应体系及程序同1.1，产物用1.0 %的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.4 转BpmiR156 白桦扦插生根及解剖鉴定

取转BmiR156过表达白桦株系及非转基因对照白桦当年生嫩枝剪成含有2 个芽点的插穗，在由多菌灵（50%）处理的基质（V（黑土）∶V（草炭土）∶V（蛭石）=2∶2∶1）中扦插，附上保鲜膜，放置在植物培养室中培养，培养条件为：室温25 ℃，16 h 光照/8 h 黑暗。扦插30 d 统计转miR156过表达白桦株系及对照白桦扦插生根率。并在扦插后0、3、6、9、12、15、18、21 d 分别切取插穗基部5 mm 长茎段用于石蜡切片的制备，石蜡切片的制备方法参见文献[16]。

2 结果与分析

2.1 BpmiR156 的克隆与pGWB2−BpmiR156 过表达载体构建

以白桦转录组数据为参考，设计特异引物克隆包括miR156成熟序列的254 bp 的cDNA 序列，经RT−PCR 扩增，在254 bp 处获得与目标条带的大小一致的特异条带（如图1a）。纯化后的PCR 产物经TOPO 反应后，所挑取的13 个单克隆中12 个检测为阳性，表明目的基因已经成功整合到了TOPO 载体上（见如图1b），选取其中的2 个单克隆进行测序分析，测序结果证明已成功克隆目标序列。

图1 白桦miR156 的克隆Fig.1 Cloning of B.platyphylla miR156 gene

提取经检测为阳性克隆的质粒进行LR 反应（图2），挑取的5 个单克隆进行PCR 检测均为阳性，目的基因miR156已成功构建到了pGWB2载体上。

图2 LR 反应后菌液PCR 检测电泳图谱Fig.2 PCR detection electrophoresis pattern of bacterial liquid after LR reaction

2.2 转BpmiR156 过表达白桦株系的获得及PCR检测

在不含抗生素的分化培养基上共培养经侵染后的白桦合子胚，每天脱菌2～3 次，2～3 d 后使用加有50 mg/L 的潮霉素的选择培养基倒置培养，期间不定期脱菌，15～20 d 后可见白桦合子胚切口处长有绿色的愈伤；待愈伤长到适宜大小，用刀片切下，置于分化培养基上，数日后浅黄色愈伤逐渐变为绿色愈伤组织，慢慢形成不定芽；再经过20～30 d 左右，不定芽逐渐分化长大形成丛生苗，丛生苗二次分化（图3），最终获得8 个超表达转化子，分别命名为Oxm156−1～Oxm156−8。

图3 miR156 转化子的获得及生长过程Fig.3 Obtaining and growth process of miR156 transformant

以非转基因对照株系及转基因株系叶片DNA作为模板，分别以基因序列设计上游引物，以载体序列设计下游引物进行PCR 检测，产物以1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳，结果显示转基因株系扩增出目标条带，与阳性对照一致，而非转基因白桦（WT）没有扩增出条带，说明miR156已成功整合到白桦基因组中（图4）。

图4 转miR156 基因植株的PCR 检测Fig.4 PCR test of miR156 transgenic lines

2.3 转BpmiR156 过表达白桦株系扦插生根率

取2 年生转基因及非转基因对照株系的当年生嫩枝，截取带2 个芽点的茎段将其扦插到基质中，此过程不加任何激素处理。30 d 后统计发现：在相同培养条件下，非转基因对照株系茎段生根率为0，而转miR156白桦株系扦插生根率高达80%以上（图5）。

图5 转miR156 过表达白桦株系及WT扦插生根情况统计Fig.5 Rooting statistics of transgenic B.platyphylla lines with miR156 overexpression and WT cuttings

2.4 转BpmiR156 过表达白桦株系不定根发生过程解剖观察

通过石蜡切片分析转miR156白桦扦插生根过程发现：转miR156白桦当年生嫩枝茎段由周皮、维管束和皮层3 种组织系统构成。茎段横切面最外层为周皮，细胞排列紧密没有空隙，细胞为长方形，周皮以下为皮层，皮层细胞较大而排列疏松。皮层内由次生韧皮部、次生木质部、维管形成层和髓组成，在次生韧皮部和次生木质部内，有由单列细胞辐射排列形成的的维管射线。由对未进行处理的茎段解剖观察结果可知，在白桦的插穗中无先生根原基（图6a）。

在扦插后第3 天时，解剖观察发现茎段次生韧皮部外侧处的维管射线细胞横向分裂加宽，向髓心一侧的维管射线仍为单列（见图6b）。在扦插后第6 天时，观察到在维管射线细胞加宽处形成了薄壁细胞团，这些薄壁细胞排列紧密，细胞核较大，易与周围细胞区分开（见图6c）。在扦插后的9 d 时，薄壁细胞团恢复分生能力之后，向着周皮方向发展，分化出了根原基发端细胞，这些根原基发端细胞细胞质浓，染色更深（见图6d）。在12 d 时，根原基发端细胞不断分裂，形成体积较小的细胞，构成了早期根原基，根原基首次突出表皮（见图6e）。在15 d 时，根原基内部出现明显的分层，外层细胞圆周排列，形成如根冠一样的保护结构，以下是体积较小而排列紧密的分生细胞（见图6f）。随着分生细胞的不断分裂和生长，根原基在发育过程中不断挤压外部的韧皮部、皮层和周皮，在18d 时，分化出来的根原基突破周皮,从周皮裂口处伸出（见图6g）。在扦插第21 天时，不定根内部分化出的的维管束与茎中维管束相连（见图6h）。

图6 转miR156 过表达白桦株系不定根发生过程的解剖观察Fig.6 Anatomical observation of the adventitious root formation process of the transgenic B.platyphylla line with miR156 overexpression

根据解剖观察不定根的形成过程可知，转miR156白桦嫩枝中不存在先成根原基，而是诱导生成根原基。在扦插生根过程中，不定根的产生属于皮部生根类型，生根处没有愈伤组织形成，愈伤组织起源及发育更晚，且愈伤组织中未见根原基发生。

3 结论与讨论

扦插是优良树种营养繁殖的重要方式，不定根的生成是扦插成功的关键。不定根的发生受很多因素影响，但一般而言，不定根发生的能力随植物幼年向成熟转变而下降。而植物从幼年向成年的转变是由miR156表达的减少诱导的。研究发现，miR156表达量升高的烟草（Nicotiana tabacum）35S：MdMIR156a6 植株在MS 培养基上培养13 d后，插条不定根数量是野生型的4 倍以上，且不定根发育速率明显快于野生型植株，而miR156表达受到抑制的35S：MIM156 插条几乎没有观察到不定根[17]。这一点在玉米[10]、拟南芥[18]、番茄（Solanum lycopersicum）[19]等中也已经得到证实。在木本植物白桦中也发现，miR156过量表达显著提高了白桦的生根率。这表明miR156在草本和木本植物中均参与了植物的不定根发生过程。miR156的靶基因是植物特有的转录因子SPL（SQUAMOSA promoter binding protein-like）家族[20]，SPL家族具有高度保守的SBP结构域。miR156与其靶基因SPL在时间表达模式上相反：在植物幼苗期，miR156含量最高随后降低，而SPL 的表达随营养阶段的转变逐渐升高，即miR156通过负调控其靶基因的表达来诱发植物的时相转变，从而调控植物的生长发育[21−22]。在拟南芥中，过表达miR156转基因植株的侧根数量是野生型的两倍，而沉默miR156或过表达SPL 植株侧根数量远少于野生型[23]。

Xu 等[17]解剖观察野生型、表达转基因株系35S：MdMIR156a6 和表达35S：MIM156 烟草植株茎的连续横截面发现，与野生型相比，35S：MdMIR156a6 插条不定根原基的发生较快且发育良好。相反，在整个试验过程中，35S：MIM156插条没有观察到不定根原基。本研究在解剖观察过表达miR156转基因白桦扦插不定根发生过程中发现，与使用外源激素处理的野生型白桦嫩枝扦插时的不定根发生过程相比[24]，转基因白桦维管射线细胞加宽过程的出现和薄壁细胞团的形成时间更早，维管射线细胞加宽到形成薄壁细胞团的时间更短，即根原基的诱导产生更早。另外，转基因株系的射线细胞加宽处位于韧皮部外侧，而在野生型白桦嫩枝扦插不定根形成的解剖观察[22]中，观察到射线细胞从形成层交叉处的位置加宽。

综上所述，本研究在克隆了miR156成熟序列的基础上，构建了pGWB2−miR156过表达载体，通过农杆菌介导法成功获得了8 个miR156过表达白桦株系。在相同的培养条件下，转miR156过表达白桦株系嫩枝扦插生根率远高于野生型白桦株系，并在解剖层面上进一步验证了转miR156过表达白桦易生根，为miR156调控不定根发生提供理论基础揭示提供新思路。但转miR156过表达白桦株系在扦插不定根发生过程中，插条体内的内源激素、营养物质、氧化酶活性等如何变化；miR156基因在分子层面上是如何诱导调控白桦嫩枝扦插生根的；这些问题还有待进一步研究探讨。