樟叶越桔悬浮培养细胞次生代谢产物的LC−MS 分析

武波晓 付 羚 李楚然 刘 云 唐军荣 杨晓琴 马焕成 赵 平,3

（1.西南林业大学西南地区林业生物质资源高效利用国家林业和草原局重点实验室，云南 昆明 650233；2.西南林业大学西南地区生物多样性保育国家林业和草原局重点实验室，云南 昆明 650233；3.云南森林资源培育与利用协同创新中心，云南 昆明 650233）

樟叶越桔（Vaccinium dunalianum）为杜鹃花科（Ericaceae）越桔属（Vaccinium）野生植物，主要分布于四川、贵州、云南和西藏等地，其全株具有祛风除湿、舒筋活络等功效[1−2]。该植物的幼嫩叶芽富含氨基酸等多种营养成分，经杀青、蒸制、干燥后所得的产品在云南彝族民间又称“雀嘴茶”，据记载自明朝起一直饮用至今[3−4]。雀嘴茶富含咖啡酰熊果苷类物质[5−7]，其主要成分6′−O−咖啡酰熊果苷（6′−O−caffeoylarbutin）对黑色素生成的抑制效果和安全性均优于目前市场主流的美白活性添加剂熊果苷[8]，且具有良好的降血脂活性[9]，表明该类物质有望作为熊果苷替代品加以开发应用。随着近年来市场对雀嘴茶的需求日益增加，樟叶越桔连年遭受破坏性采摘，导致其资源蕴藏量日趋减少。因此，利用组织培养技术开展樟叶越桔活性物质的生产等相关研究，对于该资源的可持续利用具有重要意义。

植物细胞悬浮培养具有不受地理环境、季节、气候条件的约束和病虫害影响，生长周期短，产量高等显著优点，是连续、稳定获取目标代谢物和保护野生植物资源的有效途径[10]。近年来，利用该技术在人参（Panax ginseng）、西洋参（P.quinquefolius）、三七（P.notoginseng）、紫草（Lithospermum erythrorhizon）和红豆杉（Taxus chinensis）等1 000 余种药用植物的次生代谢产物生产上开展了许多研究[11]。罗旭璐等[12]、于晓锐等[13]和付羚等[14]先后建立了樟叶越桔的组培苗快繁、扦插和细胞悬浮培养体系，尚俊可等[15]和谭亚婷等[16]初步探讨了植物生长激素NAA 和IBA 对组培苗熊果苷类成分含量的影响，但细胞悬浮培养体系是否具有咖啡酰熊果苷类等活性代谢产物的生产能力尚不清楚。本试验采用LC−MS 技术，对樟叶越桔悬浮培养细胞的甲醇提取物进行代谢产物分析，以期为利用该悬浮培养体系阐明咖啡酰熊果苷类等活性物质的高产机制及其进一步的生产调控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

1.1.1 实验材料

以樟叶越桔新鲜幼嫩叶片为外植体，在木本植物培养基（WPM）+2.0 mg/L 6−苄氨基腺嘌呤（6−BA）+0.05% mg/L 萘乙酸（NAA）+2.0 mg/L 2,4−二氯苯氧乙酸（2,4−D）+30%蔗糖条件下进行愈伤组织诱导，所得愈伤组织在WPM+2.0 mg/L玉米素（ZT）+0.4 mg/L NAA+30%蔗糖条件下进行增殖培养，得到的蓬松愈伤组织在WPM 3/5 有机+2.0 mg/L ZT+0.4 mg/L NAA+30%蔗糖条件下培养14 d 后的樟叶越桔悬浮细胞[14]供本研究后续使用。

1.1.2 仪器与试剂

CBM30A UPLC 超高效液相色谱（岛津科学仪器股份有限公司，日本），4500 QTRAP 串联质谱（赛默飞应用生物系统公司，美国），D11961 超纯水机（Thermo 公司，美国），MM 400 研磨仪（弗尔德集团公司，德国），CF16RXII 台式高速冷冻离心机（日立公司，日本），BCD−215TD GA 冰箱（青岛海尔股份有限公司，中国），QL−901 涡旋振荡器（江苏海门市麒麟医用仪器厂，中国），0.22 μm 微孔滤膜（合肥新恩源生物技术有限公司，中国），色谱纯乙腈（上海拜力生物科技有限公司，中国），色谱纯甲醇（上海科雅生物科技有限公司，中国），色谱纯乙醇（上海科雅生物科技有限公司，中国）。

1.2 实验方法

1.2.1 樟叶越桔悬浮细胞甲醇提取物的制备

取培养14 d 的适量樟叶越桔悬浮细胞，用180 目筛滤除培养液后进行真空冷冻干燥，采用研磨仪在30 Hz 条件下研磨成均匀粉末备用。精确称取100 mg 粉末样品，置于1 mL 70%甲醇水溶液的样品瓶中，在涡旋振荡器上充分涡旋提取3 次后，在4 ℃、13 000 r/min 条件下高速离 心10 min，所得上清液用0.22 μm 微孔滤膜过滤后供LC−MS 分析用。

1.2.2 LC−MS 分析条件

色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相A 为含0.04% 乙酸的超纯水，B 为含0.04%乙酸的乙腈；梯度洗脱程序为5% B～95%B（0～11 min），95% B（11.1～12 min），5% B（12.1～15 min）；流速为0.4 mL/min。柱温40 ℃，进样量为5 μL。质谱条件：正负离子电喷雾离子源（ESI），温度为550 ℃，质谱电压为5 500 V，帘气（CUR）为25 psi，扫描范围为70～1 000m/z。

1.3 数据处理

采用MassBank（http://www.massbank.jp/ ）、KNAPSAcK（http://kanaya.naist.jp/KNApSAcK/ ）、HMDB（http://www.hmdb.ca/）、MoTo DB（http://www.ab.wur.nl/moto/）和METLIN（http://metlin.scripps.edu/index.php）等已有的公共质谱数据库[17−18]对代谢物进行分析鉴定。利用三重四级杆质谱的多反应监测模式（MRM）分析方法[19]，排除非目标离子干扰后对所有代谢物质谱峰进行峰面积积分及积分校正，并采用面积归一法计算出各代谢物的相对含量。

2 结果与分析

从樟叶越桔悬浮培养细胞甲醇提取物中共分析鉴定出208 个化合物，包括酚酸类、黄酮类、萜类、原花青素类、苯丙素类和生物碱类等。其中，以酚酸和黄酮类为主，化合物数量分别为79 个和70 个，相对含量分别占全部化合物的33.244%和23.167%。萜类、原花青素类、苯丙素类、生物碱类和其他类化合物的数量分别为15、12、12、11 个和9 个，它们的相对含量分别为19.786%、15.138%、1.401%、2.200% 和5.064%（图1）。相对含量大于1%的化合物共有26 个，包括7 个酚苷、4 个三萜、4 个原花青素、3 个酚酸、2 个二氢黄酮苷、2 个胺类，以及黄酮苷、黄酮醇苷、环烯醚萜苷和黄烷3-醇各1 个，它们的相对含量总和为72.180%（表1）。

图1 悬浮细胞甲醇提取物代谢物的分类和相对含量Fig.1 Classification and relative contents of metabolites in methanol extract of cell suspension culture

2.1 酚酸类化合物分析

由表1 可知，酚酸类化合物是樟叶越桔悬浮细胞中占比最大的一类物质，由34 个酚苷和45 个其他酚酸类衍生物构成，其相对含量分别为22.072%和11.172%。

表1 樟叶越桔悬浮细胞培养物中的主要代谢产物Table 1 The main secondary metabolites in cell suspension culture of V.dunalianum

酚苷类化合物包含有樟叶越桔苷B（3.705%）、芥子酸吡喃葡萄糖酯（2.624%）、芥子酸4−O−葡萄糖苷（2.152%）、2,5−二羟基苯甲酸−O−葡萄糖苷（1.935%）、樟叶越桔苷A（1.832%）、樟叶越桔苷C（1.263%）、阿魏酸4−O−葡萄糖苷（1.254%）、1−O−[(E)−对香豆酰]−β−D−吡喃葡萄糖（0.996%）、5−(2−羟乙基)−2−O−葡萄糖基苯 酚（0.915% ）、3,4,5−三甲氧基苯基 1−O−D−葡萄糖吡喃苷（0.838%）、紫丁香苷（0.595%）、夹竹桃苷（0.497%）、对香豆酸−O−葡萄糖苷（0.489%）、水杨酸−O−葡萄糖苷（0.460%）、6′−O−咖啡酰熊果苷（0.444%）、葡萄糖氧基苯甲酸（0.429%）、6−O−乙酰熊果苷（0.313%）、丁香酸−O−葡萄糖苷（0.277%）、6−O−反式咖啡酰−β−D−吡喃葡萄糖（0.186%）、β−D−呋喃果糖基−α−D−(3−芥子酰基) 葡萄糖苷（0.183%）、异水杨酸−O−葡萄糖苷（0.169%）、1′−O−香草酰−β−D−葡萄糖苷（0.087%）、顺−对−肉桂酸 4−O−葡萄糖苷（0.076%）、3−O−对香豆酰莽草酸−O−葡萄糖苷（0.071%）、3−O−没食子酰基−β−D−葡萄糖（0.061%）、葡萄糖没食子鞣苷（0.060%）、3−羟基−4−异丙基苯甲基乙醇−3−葡萄糖苷（0.036%）、阿魏酸−白藜芦醇苷（0.026%）、迷迭香酸葡萄糖苷（0.024%）、6−O−没食子酸−β−D−吡喃葡萄糖苷（0.023%）、3−O−对香豆酰奎宁酸−O−葡萄糖苷（0.018%）、香草酸葡萄糖苷（0.017%）、水杨苷（0.011%）和3−异戊烯基−4−O−β−D−吡喃葡萄糖−4−羟基苯甲酸（0.006%）。

45 个其他酚酸类衍生物包含有1,3−二阿魏酰甘油酯（2.682%）、三羟基肉桂酰奎宁酸（2.636%）、香兰素（1.838%）、邻苯二甲酸酐（0.915%）、4−羟基苯甲醛（0.486%）、原儿茶酸（0.463%）、阿魏酸（0.288%）、对羟基苯甲酸（0.202%）、丁香醛（0.199%）、阿魏酰芥子酰酒石酸（0.156%）、阿魏酰阿魏酰酒石酸（0.131%）、短叶苏木酚酸（0.125%）、对香豆酰阿魏酰酒石酸（0.124%）、龙胆酸（0.100%）、4−羟基−3−甲氧基肉桂醛（0.081%）、咖啡酸（0.079%）、对香豆酸甲酯（0.074%）、对香豆酰咖啡酰酒石酸（0.067%）、芥子酰−p−香豆酰酒石酸（0.055%）、没食子酸（0.047%）、对香豆酸（0.047%）、绿原酸（0.046%）、4−甲氧基肉桂醛（0.037%）、松柏醛（0.029%）、香草酸（0.022%）、绿原酸甲酯（0.020%）、芥子酸（0.019%）、反式−4−羟基−3−甲氧基肉桂酸（0.019%）、芥子醇（0.019%）、丁香酸（0.018%）、对−香豆醇（0.017%）、咖啡醛（0.016%）、对氨基苯甲酸（0.015%）、1−O−对香豆酰甘油（0.015%）、阿魏酰苹果酸（0.014%）、反式对羟基肉桂酸甲酯（0.012%）、氢化肉桂酸（0.011%）、苯甲酸（0.009%）、1−O−阿魏酰−3−O−对香豆酰甘油（0.008%）、儿茶酚（0.008%）、肉桂酸乙酯（0.007%）、3,4−二甲氧基肉桂酸（0.006%）、香豆醛（0.004%）、二对香豆酰酒石酸（0.004%）和3−氨基水杨酸（0.003%）。

其中，10 个化合物的相对含量大于1%，分别为樟叶越桔苷B、1,3−二阿魏酰甘油酯、三羟基肉桂酰奎宁酸、芥子酸吡喃葡萄糖酯、芥子酸4−O−葡萄糖苷、2,5−二羟基苯甲酸−O−葡萄糖苷、香兰素、樟叶越桔苷A、樟叶越桔苷C 和阿魏酸4−O−葡萄糖苷（表1）。此外，樟叶越桔苷A−C、6′−O−咖啡酰熊果苷、6−O−乙酰熊果苷、6′−O−反式咖啡酰吡喃葡萄糖、阿魏酸4−O−葡萄糖苷、咖啡酸和绿原酸等9 个化合物曾从雀嘴茶中分离得到[5]。

2.2 黄酮类化合物分析

由表1 可知，黄酮类化合物为樟叶越桔悬浮细胞中的第二大类代谢产物，包含58 个黄酮苷类和12 个其他黄酮类化合物，相对含量分别为13.765%和9.402%。其中，黄酮苷类又可分为黄酮醇苷36 个，黄酮碳苷8 个、黄酮苷6 个、二氢黄酮苷5 个、二氢黄酮碳苷1 个、异黄酮苷1 个和查耳酮苷1 个。在所有黄酮类化合物中，相对含量大于1%的化合物有5 个，其中黄烷3−醇类化合物—儿茶素的含量最高，为8.030%；其次分别为黄酮苷—苜蓿素−O−葡萄糖二酸（2.392%）、二氢黄酮苷—柚皮素−4′−O−葡萄糖苷（1.966%）和樱桃苷（1.022%）、和黄酮醇苷—槲皮素−3−O−β−D−半乳糖苷（1.105%）。

黄酮醇苷类化合物分别鉴定为槲皮素−3−O−β−D−半乳糖苷、异金丝桃苷（0.715%）、绣线菊苷（0.713%）、6−羟基山柰酚−7−O−葡萄糖苷（0.704%）、异鼠李素−3−O−葡萄糖苷（0.595%）、异鼠李素−7−O−葡萄糖苷（0.585%）、槲皮素−3−O−β−D−葡萄糖苷（0.525%）、槲皮素−7−O−葡萄糖苷（0.420%）、番石榴苷（0.217%）、槲皮素−3−O−β−D−吡喃木糖苷（0.110%）、槲皮素−3−O−洋槐糖苷（0.073%）、槲皮素−3−O−芸香糖苷（0.060%）、山柰酚−7−O−葡萄糖苷（0.055%）、山柰酚−3−O−洋槐糖苷（0.039%）、山柰酚−3−O−芸香糖苷（0.036%）、槲皮素−3−O−（6″−O−丙二酰）−半乳糖苷（0.035%）、檞皮素−3−阿拉伯糖基葡萄糖苷（0.027%）、6−羟基山柰酚−7,6−O−二葡萄糖苷（0.027%）、槲皮素−O−阿魏酰戊糖苷（0.026%）、槲皮素−3−O−桑布双糖苷（0.026%）、异鼠李素−O−己糖−O−己糖（0.026%）、槲皮素−3−O−β−D−木糖−（1→2）−β−D−半乳糖苷（0.025%）、山柰酚−3−O−（6″−丙二酰）−葡萄糖 苷（0.024%）、山柰酚−3−O−β−D−槐糖苷（0.021% ）、槲皮素−O−芸香苷−己糖（0.021%）、槲皮素−3,7−O−β−D−二葡萄糖苷（0.021% ）、杨梅素−3−O− 半乳糖苷（0.019%）、柠檬素−3−鼠李糖苷（0.019%）、棉黄素−3−葡萄糖苷（0.018%）、山柰酚−3−O−葡萄糖苷−7−O−鼠李糖苷（0.009%）、杨梅素−3−O−阿拉伯糖苷（0.008% ）、杨梅苷（0.007%）、槲皮素−O−戊糖苷−O−己糖苷−O−己糖苷（0.007%）、异鼠李素−3−O−阿拉伯糖苷（0.006%）、6−羟基山柰酚−3,7,6−O−三葡萄糖苷（0.004%）和山柰酚−3−O−阿拉伯糖苷（0.002%）。

8 个黄酮碳苷分别为芹菜素−6−C−葡萄糖苷（0.089%）、芹菜素−6−C−2−葡萄糖醛酸基木糖苷（0.072%）、芹菜素−8−C−葡萄糖苷（0.029%）、金雀异黄素−8−C−葡萄糖苷（0.027%）、5,7,4'−三羟基−8−C−β−D−葡萄糖黄酮（0.024%）、8−C−己糖苷−木犀草素−O−己糖苷（0.013%）、芹菜素−6,8−C−二葡萄糖苷（0.009%）、木犀草素−6−C−葡萄糖苷（0.004%）。

6 个黄酮苷分别为苜蓿素−O−葡萄糖二酸、香叶木素−7−O−半乳糖苷（0.484%）、木犀草素−7−O−葡萄糖苷（0.031%）、芹菜素 7−O−葡萄糖苷（0.024%）、木犀草素−7−O−芸香糖苷（0.013%）和苜蓿素−O−芸香糖苷（0.002%）。5 个二氢黄酮苷分别为柚皮素−4′−O−葡萄糖苷、樱桃苷、橙皮素5−O−葡萄糖苷（0.614%）、橙皮素−7−O−葡萄糖苷（0.043%）和乔松素−7−O−β−D−葡萄糖苷（0.014%）。1 个二氢黄酮碳苷为异柚葡萄糖苷（0.015%），1 个异黄酮苷为2'−羟基−5−甲氧基−染料木素−O−鼠李糖苷−葡萄糖苷（0.015%）和1 个查耳酮苷为根皮苷（0.533%）。

其他黄酮类衍生物包括5 个黄烷3−醇[儿茶素、表儿茶素（0.386%）、没食子儿茶素（0.028%）、表儿茶素没食子酸酯（0.008%）和儿茶素没食子酸酯（0.008%）]、2 个二氢黄酮醇[花旗松素（0.621%）和短叶松素（0.010%）、2 个黄酮醇[3,4−二氧−甲基槲皮素（0.106%）和杨梅素（0.006%）]、2 个二氢黄酮[ 圣草酚（0.084%）和柚皮素（0.009%）、和1 个查耳酮[4,2′,4′,6′−四羟基查耳酮（0.106%）]。

2.3 萜类化合物分析

由表1 可知，从樟叶越桔悬浮细胞中共分析鉴定出15 个萜类化合物，包括8 个三萜、2 个二萜和5 个环烯醚萜苷。三萜分别为马斯里酸（7.503%）、2−羟基齐墩果酸（7.318%）、熊果酸（1.359%）、24−羟基齐墩果酸（1.261%）、咖啡酰山楂酸（0.565%）、2,3−二羟基5(6)，12(13)−二烯熊果酸（0.139%）、3−O−(2−O−乙酰基−β−D−吡喃葡萄糖基)齐墩果酸（0.051%）和甲氧基熊果酸（0.013%）。二萜分别为2,6−二甲基−7−辛 烯−2,3,6−三 醇（0.261% ）和ailantinol E（0.066%）；环烯醚萜苷分别为水晶兰苷（1.019%）、水晶兰苷甲酯（0.094%）、二氢水晶兰苷甲酯（0.074%）、3′−O−D−葡萄糖酰龙胆苦苷（0.033%）和鸡矢藤次苷（0.030%），其中水晶兰苷和鸡矢藤次苷曾从雀嘴茶中分离得到[5]。相对含量大于1% 的萜类化合物为马斯里酸、2−羟基齐墩果酸、熊果酸、24−羟基齐墩果酸和水晶兰苷。

2.4 原花青素类、苯丙素类、生物碱类和其他类化合物分析

由表1 可知，从樟叶越桔悬浮细胞中共分析鉴定出12 个原花青素、12 个苯丙素、11 个生物碱和9 个其他类型化合物。原花青素类包括原花青素A1（1.198%）、A2（8.655%）、B1（0.725%）、B2（0.499%）、B3（0.411%）、B4（1.663%）、C1（0.397%）和C2（0.101%），肉桂单宁A2（0.006%）、B2（0.059%）和D1（1.264%），以及表儿茶素−表阿夫儿茶精（0.160%）。其中，4 个化合物的相对含量大于1%。

苯丙素类化合物包含有8 个木脂素，丁香树脂酚−己糖（0.546%）、松脂醇二葡萄糖苷（0.405%）、（0.131%）、松脂醇单葡萄糖苷（0.046%）、丁香树脂酚（0.034%）、1−羟基松脂素单葡萄糖苷（0.025%）、丁香树脂醇−4′−O−β−D−单葡萄糖苷（0.012%）和1−羟基松脂素二葡萄糖苷（0.009%）；4 个香豆素，异莨菪亭（0.093%）、茵芋苷（0.052%）、秦皮甲素（0.038%）和东莨菪内脂（0.010%）。

生物碱类衍生物包含有N−苯亚甲基异甲胺（0.684%）、6−脱氧荞麦碱（0.447%）、甜菜碱（0.422%）、烟酸甲酯（0.278%）、L−莨菪碱（0.227%）、吲哚−3−甲醛（0.082%）、3−羟丙基棕榈酸酯葡萄糖胺（0.028%）、椰油酰胺丙基甜菜碱（0.016%）、氨基嘌呤（0.009%）、2−（β−D−吡喃葡萄糖基氧基）−4−羟基苯乙腈（0.004%）和吲哚（0.003%）。

其他类化合物包含有N−乙酰基腐胺（2.351%）、胍丁胺（2.154%）、4−甲基−5−噻唑乙醇（0.330%）、虎杖苷（0.102%）、N−乙酰−D−半乳糖胺（0.049%）、tababiphenyl C（0.039%）、苄基−β−D−吡喃葡萄糖基(1−6)−β−D−吡喃葡萄糖苷（0.021%）、N−乙酰葡萄糖胺 1−磷酸（0.016%）和白藜芦醇−O−二葡萄糖苷（0.004%）。

3 结论与讨论

采用LC−MS 联用技术从樟叶越桔悬浮培养细胞的甲醇提取物中共分析鉴定出208 种次生代谢产物，其中包括酚酸类79 个、黄酮类70 个、萜类15 个、原花青素类12 个、苯丙素类12 个、生物碱类11 个和其他类衍生物9 个，相对含量分别 为33.244%、23.167%、19.786%、15.138%、1.401%、2.200%和5.064%。酚酸类化合物中包含酚苷34 个和其他酚酸衍生物45 个，相对含量分别为22.072% 和11.172%，黄酮类化合物中包含黄酮苷类58 个和其他黄酮类衍生物12 个，相对含量分别为13.765% 和9.402%。相对含量大于1%的化合物共有26 个，相对含量总计为72.180%，为樟叶越桔悬浮培养细胞的主要代谢产物。其中，含量最高的化合物为原花青素A2（8.655%），其次为儿茶素（8.030%）、马斯里酸（7.503%）、2−羟基齐墩果酸（7.318%）和樟叶越桔苷B（3.705%）。

大量研究发现，酚酸类、黄酮类、原花青素类、萜类等代谢产物具有显著的抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和降血糖等多种生理活性[20−27]，表明樟叶越桔悬浮细胞培养体系有望为生产原花青素A2 等活性物质提供一条新的途径。Luo 等[7]的HPLC 定量分析研究发现，6′−O−咖啡酰熊果苷、绿原酸和熊果苷为樟叶越桔的3 个主要化学成分，它们在樟叶越桔幼嫩叶片（本研究使用的外植体）中的含量分别为2.952%、0.744%和0.706%，本研究从悬浮培养细胞中首次检测到6′−O−咖啡酰熊果苷（0.444%）和绿原酸（0.046%），与外植体中的含量差异较大，值得进一步深入系统地开展悬浮细胞次生代谢产物的生产调控研究。与雀嘴茶相似，酚苷类代谢产物在樟叶越桔悬浮培养细胞中最为丰富，其中樟叶越桔苷A−C、6′−O−咖啡酰熊果苷、6−O−乙酰熊果苷、6′−O−反式咖啡酰吡喃葡萄糖、阿魏酸4−O−葡萄糖苷、咖啡酸和绿原酸等化合物曾从雀嘴茶中分离得到[5]。这些酚苷类化合物分子多样性的存在；同时也提示樟叶越桔及其悬浮培养细胞中含有丰富多样的芳香族酰基转移酶和糖基转移酶的基因[28−29]。开展这些转移酶基因的分子生物学相关研究，将为进一步阐明樟叶越桔中咖啡酰熊果苷类物质的高产机制提供科学依据。