一株耐酸、高产淀粉酶酵母菌的筛选及初步鉴定

陈 阔，欧阳英，何天翔，卢炜琪，尹乐斌

（邵阳学院食品与化学工程学院，湖南邵阳 422000）

大曲的主要原料是小麦，形状类似砖块，具有丰富的菌系和酶系，是一种酿酒用的糖化剂及发酵剂，且含有多种能水解和发酵底物的产酶微生物。酿酒的主要原料由高粱、小麦、玉米等组成，其中含有大量淀粉，淀粉是自然界中的第二大多糖储备物质，是许多食品与非食品行业的重要组成部分[1]。大曲中能产生淀粉酶的微生物有霉菌、酵母菌、青霉菌和细菌等，其中淀粉酶已被广泛运用于酿酒、纺织与烘焙等行业生产，除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物[2]。

为解决酿酒过程中淀粉浆液化糖化中的调温度与调节pH 等步骤，本文通过考察形态学、生理生化特性，利用液体发酵法对产淀粉酶培养基发酵条件进行优化，从邵阳大曲中筛选出了一株耐酸、高产淀粉酶的酵母菌。而在不同的地域制备的大曲，其微生物多样性可能存在不同。张双燕[3]利用MiSeq 高通量技术分析北京地域的清香型大曲微生物多样性，得出真菌中的优势菌是假丝酵母、曲霉属等。胡晓龙[4]使用同样的方法对河南省地域的大曲微生物群落多样性进行分析，得出真菌中优势菌种是扣囊复膜酵母、雪黄散囊菌等。由此得出不同地域的气候、地势环境、大曲制作方法的不同均可能对大曲中微生物的多样性产生影响。对于白酒行业来说，筛选出具有地域特色的高品质微生物能提升出酒率和酒的品质，进而改善传统制曲工艺。故此，对湖南邵阳地区的大曲微生物的筛选与研究显得极为必要。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

湖南省邵阳市湘窖酒业有限公司高温包包曲。

1.1.2 主要培养基与试剂

（1）培养基。①初始发酵培养基：可溶性淀粉20 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、自来水1 L、pH 值7.0，121 ℃灭菌25 min。②初选培养基：玉米淀粉20 g、K2HPO41.0 g、NaNO33 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼 脂 粉13 g、氯 霉 素0.005 g、定容至1 L 锥形瓶中，pH 值 5.5 ～6.0，121 ℃灭菌25 min。③马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。④YEPD 培养基：酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1000 mL，115 ℃湿热灭菌20 min。

（2）试剂。硝酸钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、麦芽糖、3,5-二硝基水杨酸、酵母膏和琼脂粉等由邵阳学院生化实验室提供；氯霉素购于药店。

1.1.3 主要仪器设备

LE438 型pH 计：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；DH-420 型电热恒温培养箱：北京科伟永兴仪器有限公司；UV-3802 型紫外分光光度计：重庆万达仪器有限公司；H21-6 型电热恒温水浴锅：北京市东霞电子仪表厂；JI54DWS 型高压蒸汽灭菌锅：致微厦门仪器有限公司等。

1.2 试验方法

1.2.1 大曲发酵

取1 g大曲接种于发酵培养基中，40 ℃，150 r/min振荡培养24 h。

1.2.2 菌株初筛

取发酵培养液1 mL，于99 mL 的无菌水三角瓶中，振荡均匀，即为稀释度10-2的粉末悬液。再依次进行梯度稀释，获得稀释度为10-3、10-4、10-5和10-6的大曲稀释液。分别取10-4、10-5、10-6稀释液0.1 mL 涂布于筛选平板上，28 ℃恒温箱中培养24 h。挑取培养基上不同形态的菌落进行平板划线，得到单个菌落。喷洒碘液，若菌落出现白色透明圈，则说明此菌可产生淀粉酶，挑选有透明圈的菌落备用，并制作表格统计D/d值，初步筛选产淀粉酶菌株。

1.2.3 菌株复筛

高产淀粉酶菌株的筛选：将初筛出的纯菌种接种于250 mL 发酵培养基中，37 ℃、250 r/min 摇床培养2 d。取发酵液1 mL 于8 000 r/min 下离心10 min，取上清液测酶活力，每个样品重复3 次，结果取平均值。

1.2.4 耐酸性筛选

将筛选出的两株高产性菌株分别同时接种于YPED 液体培养基中，28 ℃恒温培养1 d，种子活化液浓度为1.0×107CFU/mL，设置5 个不同梯度的pH值，pH 分别为2.5、3.0、3.5、4.0 和4.5，28 ℃恒温培养箱中培养3 d，吸取2×105CFU/mL 菌液1 mL 于上述不同pH 值的100 mL YPED 液体培养基中，利用紫外分光光度计测定560 nm 下菌液的OD值，OD值越大，菌株的耐酸性越强[5-6]。

1.2.5 酶活测定方法

（1）测定方法。采用DNS 法[7]测菌株的酶活力，以麦芽糖绘制标准曲线，测定试验菌株在520 nm 的吸光度。

（2）标准曲线的绘制。①取16 支洁净比色管分别编号1、2、3、4、5 和6（除6 号试管1 支外，其他每组编号各3 支），用蒸馏水冲洗，于培养箱中烘干，之后分别往比色管中依次加入0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL 和2.0 mL 麦芽糖标准溶液，DNS指示剂，蒸馏水（加入量参考文献[8])。②摇匀后于沸水中加热5 min，冷却后，各试管用蒸馏水定容至25 mL，试管6 作为对照组，其他组平行试验3 次且结果取平均值。③测定试验菌株在520 nm的吸光度，以麦芽糖量为横坐标，吸光光度值为纵坐标，得到麦芽糖含量的回归方程。

（3）酶活力单位定义。在40 ℃、pH 值 6.0 的条件下，每分钟从1%的可溶性淀粉中释放出1 mmol麦芽糖的酶量定义为1 个酶活力单位（U）[9]。

1.2.6 菌落形态观察

将初筛后的菌株平板划线，纯化，在28 ℃恒温培养箱中培养3 d，用美蓝与棉蓝溶液分别对酵母菌与霉菌进行镜检。观察平板中菌落的颜色、大小、表面的粗糙程度、镜检下的孢子形态以及菌株菌丝状态等，并且参照《真菌鉴定手册》[10]进行比较。

1.2.7 菌株生物学特性测定

（1）温度对菌株产淀粉酶能力的影响。将待测菌株接种于发酵培养基中，分别在24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃和40 ℃ 5 个温度下培养，180 r/min 条件下振荡培养2 d，取2 mL 酶液进行酶活性测定。每组设3个平行样，每个样品重复3 次，结果取平均值[11]。

（2）酒精浓度对菌株产淀粉酶能力的影响。以5%的菌液种量接种到酒精浓度为2%、4%、6%、8%和10%的高粱汁培养基中，在28 ℃，180 r/min 条件下振荡培养2 ～3 d，取2 mL 酶液进行酶活性测定。每组设3 个平行样，每个样品重复3 次，结果取平均值。

（3）酸碱度对菌株产淀粉酶的影响。以5%的菌液接种量接种到pH 值 2.5、pH 值 3.0、pH 值 3.5、pH 值 4.0 和pH 值 4.5 的高粱汁培养基中，在28 ℃，180 r/min 条件下振荡培养2 ～3 d，取2 mL 酶液进行酶活性测定。每组设3 个平行样，每个样品重复3次，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 耐酸、高产淀粉酶菌株的筛选结果

2.1.1 淀粉酶标准曲线绘制

淀粉酶标准曲线见图1，该方程为y=0.268 9x+0.0565 5，R2=0.991 9。

图1 淀粉酶标准曲线

2.1.2 高产淀粉酶菌株的筛选

从大曲中初筛分离得13 株菌株，根据培养基的颜色与菌落形态，初步观察判定为酵母菌、毛霉、青霉与黄曲霉，因黄曲霉会产生黄曲霉毒素，其是一类有毒的次生代谢产物，且广泛存在于农作物及食物中，被世界卫生组织的癌症研究机构划定为“Ⅰ”类致癌物，故复筛时将黄曲霉剔除，选取酵母菌、毛霉与青霉中透明圈直径与菌落直径较大的3 株菌株进行复筛，测定其酶活性[12]。由表1 可知，WB4与WB9 的酶活性最高，说明这两株菌株的产酶能力较好。

表1 高产淀粉酶的筛选

2.1.3 耐酸淀粉酶的筛选

将WB4 与WB9 分别接种于pH 为2.5、3.0、3.5、4.0 和4.5 的YEPD 培养基中恒温培养3 d。由表2 可知，在波长560 nm 下，且pH 在2.5 ～4.5，随着pH的变化，WB4 与WB9 的OD值至均高于前一梯度的OD值。传统酿酒工艺中，在糖化之前需将醪液pH值由6.5 降到4.5，以便糖化酶活性的最大化。因pH在4.5 的条件下，WB4 的酶活性更高，故WB4 即为所要筛选耐酸、高产淀粉酶微生物。耐酸性以及酶活结果如表2 所示。

表2 耐酸淀粉酶的OD 值测定以及酶活计算

2.2 产淀粉酶菌株形态学鉴定

从初选培养基中分离出3 种不同形态的菌株，再进行纯化，观察菌落形态与孢子特征，如图2 所示。由图2 可知，在28 ℃条件下，将菌株WB4、WB9、WB13 培养3 d，其中WB4 与WB13 菌落呈乳白色，表面呈圆形且凸起，菌落较小，边缘较为规则，菌落中单个细胞宽度约2 ～3 nm，长度5 ～6 nm，呈椭圆形，初步鉴定该菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。WB9 菌落呈雪白色，表面黏稠、湿润，边缘不规整，菌落较大，菌落中单个细胞直径约2 ～3 nm，呈卵圆状，初步鉴定为粉状米勒酵母（Millerozy mafarinose）。实验菌株形态特征与《真菌鉴定手册》和文献[13]鉴定结果一致。

图2 菌株WB4、WB9、WB13 菌落及分生孢子形态特征

2.3 菌株培养条件优化

2.3.1 温度对菌株WB4 产淀粉酶能力的影响

将菌株分别在24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃与40 ℃ 5个温度下培养2 d后，用DNS法测定其酶活性，结果如图3 所示。由图3 可知，菌株WB4 在32 ℃时，酶活性最高，平均OD值为2.877；当温度低于32 ℃时，菌株的酶活性相较之下较低；当温度高于32 ℃时，酶活性显著降低。因此，确定菌株WB4 的最适温度为32 ℃。

图3 WB4 的最适温度图

2.3.2 酒精浓度对菌株WB4 产淀粉酶能力的影响

将WB4的种子液加入含有100 mL的酒精浓度为2%、4%、6%、8%和10%的高粱汁培养基的锥形瓶中，贴好标签，置于28 ℃恒温培养箱中培养2 ～3 d后，用DNS 法测定其酶活性，结果如图4 所示。由图4 可知，当酒精浓度在2%～8%时，WB4 菌的OD值是缓慢下降，但酒精浓度在8%～10%时，WB4 的OD值下降较快。因此，WB4 菌株的耐酒精浓度为10%。

图4 WB4 对酒精浓度的耐受性测定图

3 结论

本研究从湖南省湘窖酒业有限公司中高温包包曲中筛选出13 株产淀粉酶的菌株，并对这13 株菌株进行初步的形态学观察，判定为酵母菌、毛霉、青霉与黄曲霉4 种菌株，因为黄曲霉会产生黄曲霉毒素，故不进行后续操作；其他菌株通过酶活性大小鉴定，得WB4 与WB9 这两株菌株的产淀粉酶能力较强；将WB4 与WB9 这两株菌株接种于YPED液体培养基中，再通过DNS 法对其进行酶活性大小比较，最终获得一株耐酸、高产淀粉酶菌株WB4；经过形态学观察，鉴定该菌株为酿酒酵母；通过液体发酵法确定该菌株产酶的最佳条件为：温度为32 ℃，酒精浓度为10%。本试验通过筛选耐酸性和高产性的酿酒微生物，有效解决了酿酒糖化过程前的酸碱调节问题，减少酿酒过程中不必要的环节，节约了时间，能够有效提高工业生产的产酒率，降低酿酒生产成本。