中老年冠心病患者病情发展中Notch信号通路与Toll样受体4相互作用

吉晓理 吕有凯 罗江宾 吴松岩

(1三亚市人民医院，海南 三亚 572000；2海南医学院第二附属医院)

冠心病的发生是糖尿病、高血压、高脂血症等多种危险因素共同作用的结果，中老年人为冠心病的多发群体。冠状动脉血管壁炎症反应可激活血小板黏附，促进血管内免疫细胞的聚集，导致动脉硬化斑块的形成与破裂，出现血管闭塞，是心绞痛、心肌梗死发生的病理基础之一〔1〕。Toll样受体(TLR)参与调控人体免疫应答过程，能够识别外来病原体并启动相关防御机制〔2〕。相关研究显示，急性冠状动脉综合征大鼠模型中TLR发挥免疫调控作用〔3〕。Notch信号通路参与细胞间信号传导过程，与组织器官发育和分化密切相关〔4〕；Notch信号通路还能够调控肿瘤细胞的增殖、分化和侵袭〔5〕。本研究分离培养中老年冠心病患者外周血单个核细胞，进一步分选出CD14+单核细胞，探讨冠心病病情发展中Notch信号通路与TLR4的相互作用。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2018年7月至2020年2月三亚市人民医院收治的中老年冠心病患者128例。入选标准：①年龄≥45岁，有胸痛、心悸、乏力等典型的冠心病临床症状，经冠状动脉造影确诊为冠心病；②无沟通障碍，自愿参与本研究。排除标准：合并精神性疾病、免疫系统疾病、恶性肿瘤的患者。其中男71例，女57例，年龄46～71岁；根据病情分为心绞痛组86例，男48例，女38例，平均(53.75±10.04)岁；心肌梗死组42例，男23例，女19例，平均(54.31±10.85)岁。选取55例健康志愿者为正常对照组，男31例，女24例；年龄47～69岁，平均年龄(53.72±9.40)岁。性别、年龄在各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准(批号：LDK2018016)，患者均签署知情同意书。

1.2主要试剂 胎牛血清、人外周血淋巴细胞分离液试剂盒均购于北京杰辉博高生物有限公司；CD14免疫磁珠分选试剂盒购于天津生物芯片技术有限公司；Notch信号通路抑制剂DAPT、TLR4激动剂CRX-675均购于杭州联科生物技术股份有限公司；PCR检测试剂盒购于上海代轩生物有限公司；白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α检测试剂盒购于上海研域化学试剂有限公司；兔抗人TIR结构域接头分子(TRIF)、抗髓样分化因子(MyD)88、磷酸化核因子(NF)-κB p65亚基单克隆抗体，鼠抗人β-actin单克隆抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗均购于北京拜尔迪生物有限公司。

1.3方法

1.3.1外周血单个核细胞分离 心绞痛患者、心肌梗死患者入院次日，正常对照组健康志愿者体检时，采集空腹肘静脉血12 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，进行聚蔗糖(FICOLL)密度梯度离心，收集外周血单个核细胞，滴加含10%二甲基亚砜(DMSO)的胎牛血清，液氮冷冻后用于后续实验。

1.3.2冠心病患者外周血单个核细胞中CD14+单核细胞分离与刺激培养 CD14免疫磁珠分选试剂盒分选心绞痛患者和心肌梗死患者外周血单个核细胞中的CD14+单核细胞。向24孔板中加入分选得到的CD14+单核细胞，1×105个/孔，设置6个复孔。分别加入终浓度80 μmol/ml的DAPT干预培养基、300 ng/ml的CRX-675干预培养基、DAPT与CRX-675共同干预培养基，均为2个复孔。其中DAPT与CRX-675共同干预培养基先后加入终浓度为300 ng/ml、80 μmol/ml的CRX-675、DAPT。继续培养24 h，收集各培养孔中的CD14+单核细胞和培养液。

1.3.3实时定量-PCR检测Notch2、Notch3、TLR及人内皮抑素(HES)2、HES4 mRNA表达 Trizol法提取外周血单个核细胞和CD14+单核细胞的总RNA，逆转录为cDNA，Notch2、Notch3、TLR、β-actin引物序列均参考相关文献报道〔6〕；HES2、HES4引物序列由南京信帆生物有限公司设计合成，HES2上游引物：5′-CCGTCATTAGCCGACTCAATC-3′，下游引物：5′-CTCATGTAGTGCCAGCACGAG-3′；HES4上游引物：5′-GAGAGTCATACGCATTACCGATCG-3′，下游引物：5′-CGAACCTGCCATACGTGGACCATA-3′。PCR扩增条件：94℃预变性1 min，94℃变性40 s，55℃复性40 s，共35个循环，72℃终末延伸3 min。检测各基因相对表达量。

1.3.4细胞培养液中IL-6、TNF-α表达水平检测 取心绞痛组和心肌梗死组CD14+单核细胞培养液，收集上清，酶联免疫吸附试验测定细胞培养上清液中IL-6、TNF-α表达水平。

1.3.5Western印迹检测TRIF、MyD88、NF-κB p65蛋白表达 收集心绞痛组和心肌梗死组CD14+单核细胞，高效RIPA组织细胞裂解液提取总蛋白，定量后取其中10 μg蛋白行电泳，将分离出的蛋白电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封闭2 h。洗膜后加入1∶500倍稀释的兔抗人TRIF单克隆抗体、1∶300倍稀释的兔抗人MyD88单克隆抗体、1∶1 000倍稀释的兔NF-κB p65单克隆抗体、1∶2 000倍稀释的鼠抗β-actin单克隆抗体，4℃过夜，洗涤后加入1∶2 000稀释的HRP标记二抗，室温摇床孵育2 h，化学放光法成像，使用Image进行灰度分析。

1.4统计学分析 采用SPSS24.0进行χ2检验、t检验。

2 结 果

2.13组Notch2、Notch3 mRNA表达水平比较 心肌梗死组和心绞痛组外周血单个核细胞中Notch2 mRNA表达水平明显高于正常对照组，心肌梗死组明显高于心绞痛组(均P<0.05)。Notch3 mRNA表达水平在各组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.23组TLR表达水平比较 心肌梗死组和心绞痛组外周血单个核细胞中TLR2、TLR4 mRNA表达水平明显高于正常对照组，心肌梗死组明显高于心绞痛组(P<0.05)。TLR1、TLR3、TLR5 mRNA表达水平在各组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3Notch信号通路抑制剂对CD14+单核细胞中TLR2、TLR4表达的影响分析 干预后，心肌梗死组和心绞痛组CD14+单核细胞中TLR4 mRNA表达水平明显低于干预前(P<0.01)。Notch信号通路抑制剂干预后心肌梗死组与心绞痛组CD14+单核细胞中TLR2 mRNA表达水平与干预前相比差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 Notch信号通路抑制剂干预前后两组TLR2、TLR4 mRNA相对表达量比较

2.4TLR4激动剂对CD14+单核细胞中Notch信号通路的影响分析 干预后，心肌梗死组和心绞痛组CD14+单核细胞中Notch2、HES2、HES4 mRNA表达水平明显高于干预前(P<0.01)；干预前、后心肌梗死组均显著高于心绞痛组(均P<0.01)。见表3。

2.5Notch信号通路抑制剂对TLR4介导的炎症信号通路的影响 TLR4激动剂CRX-675干预后心肌梗死组和心绞痛组细胞培养上清液中IL-6、TNF-α水平明显高于干预前(P<0.05)；Notch信号通路抑制剂DAPT与TLR4激动剂CRX-675共同干预后心肌梗死组和心绞痛组细胞培养上清液中IL-6、TNF-α水平明显低于TLR4激动剂CRX-675单独干预，但仍显著高于干预前(P<0.05)。见表4。

2.6Notch信号通路抑制剂对TLR4介导的下游信号因子表达影响分析 Notch信号通路抑制剂DAPT与TLR4激动剂CRX-675共同干预后心肌梗死组和心绞痛组CD14+单核细胞中TRIF、NF-κB p65蛋白表达水平明显低于TLR4激动剂CRX-675单独干预(P<0.01)。见表5、图1。

1～4：心绞痛组CRX-675干预，心绞痛组DAPT+CRX-675干预，心肌梗死组CRX-675干预，心肌梗死组DAPT+CRX-675干预图1 Western印迹检测两组TRIF、MyD88、NF-κB p65蛋白表达

3 讨 论

Notch和TLR信号通路参与感染性疾病和炎症性疾病的发生与发展〔7〕。近年来研究发现，Notch信号通路在冠心病患者中调控血管内皮细胞转化和功能缺失〔8〕，还能够诱发血管内皮细胞凋亡和促炎因子的活化〔9〕。下调Notch信号通路可能成为冠心病治疗的新靶点。目前关于冠心病患者外周血单个核细胞和免疫细胞中Notch信号通路相关因子的表达特点及作用仍鲜有研究报道。本研究结果提示冠心病患者外周血单个核细胞中Notch2高表达，且表达水平随病情严重程度的增加逐渐提升。研究发现，正常生理状态下和病理状态下内皮细胞来源的Notch2能够调控人体固有免疫应答和适应性免疫应答〔10〕。而免疫细胞来源的Notch2在冠心病发生与进展中的作用仍需进一步阐明。本研究结果提示冠心病患者体内Notch2和TLR4相互作用可能共同调控CD14+单核细胞功能，参与冠心病的病情发展。

相关研究显示，TLR能够调控哺乳动物体内的炎症应答〔11〕；TLR1、TLR4、TLR5基因缺陷的小鼠中动脉粥样硬化相关的炎症反应被抑制，TLR1、TLR4、TLR5能够上调活动性斑块中Wnt5a基因表达，增强炎症应答的强度〔12〕。研究显示，TLR4与中性粒细胞能够协同参与内质网应激和血管细胞凋亡，影响平滑肌细胞活性，参与动脉粥样硬化斑块的发生与发展〔13〕。本研究结果提示Notch2与TLR4相互作用可能参与心绞痛和心肌梗死的病理过程。Notch2与TLR4共同调控冠心病患者体内炎症因子分泌。相关研究显示，TLR介导的信号传导通路可通过MyD88依赖与非依赖两种途径调控NF-κB磷酸化，加速炎症因子的合成与分泌，参与免疫应答过程〔14〕。本研究结果显示，Notch信号通路抑制剂DAPT能够通过影响冠心病患者CD14+单核细胞中TLR4调控的TRIF、NF-κB p65表达，对MyD88表达影响不明显。提示中老年冠心病患者病情发展中Notch2与TLR4可能通过MyD88非依赖性途径调控CD14+单核细胞功能，影响炎症水平。