地氟烷对老年大鼠海马Aβ、Tau蛋白表达及学习记忆能力的影响

龚涛武 赵鹏程 吴振宇 杨洋 朱宇航 张超 朱昭琼

(1遵义医科大学附属医院麻醉科，贵州 遵义 563000；2贵州省麻醉与器官保护基础研究重点实验室;3遵义医科大学麻醉医学院)

地氟烷作为一种新型卤代吸入麻醉剂，具有起效快、苏醒迅速和可控性强的特点，在临床上得到广泛应用〔1〕。目前，我国接受手术的老年患者日趋增多，鉴于地氟烷的药理特点，其在老年患者的麻醉使用具有明显的优势，但有关地氟烷在老年患者中应用是否会造成患者术后发生记忆能力的损害报道较少。因此，本研究拟借助动物行为学实验及相关蛋白的研究，评价地氟烷对老年大鼠学习记忆能力的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 地氟烷(批号：H094F622)；无水乙醇(无锡展望)；磷酸盐缓冲液(PBS，无锡菩禾)；5%牛血清白蛋白(BSA)溶液(无锡菩禾)；抗原修复液(Beyotime)；Hochest染色(Beyotime)；Morris 水迷宫测试仪(成都泰盟科技有限公司)；Fabius麻醉机；Vamos气体监护仪(Draeger公司，德国)；倒置荧光显微镜(Olympus 公司型号1X71)；吸入麻醉箱(自制)；恒温培养箱(ABI-7500)；β-淀粉样蛋白(Aβ，Abcam)；Tau蛋白(武汉三鹰)。

1.2实验动物及分组 20月龄健康雄性SD老年大鼠25只，体重450～550 g，由重庆第三军医大学实验动物中心提供〔SCXK(渝)2012-0005〕。采用随机数字表法分为对照组(C组，n=5)和实验组(n=20)，其中实验组分为4个亚组即麻醉后苏醒2 h(D-2)组、12 h(D-12)组、24 h(D-24)组、72 h(D-72)组，每组5只。

1.3实验方法 水迷宫实验开始前1 d，所有大鼠先行Morris水迷宫适应性训练，剔除不会游泳的大鼠。定位航行实验(5 d)：设置平台与水面距离为2 cm，每只大鼠每天训练4次。大鼠分别于东、南、西、北4个象限中点面向池壁入水，限定大鼠在120 s内找到并爬上平台休息10 s，若120 s内未找到，则引导其找到并置于平台上休息10 s，记录逃避潜伏期。空间探索实验(1 d)：第6天移除平台，将所有大鼠从第四象限入水，游泳120 s，记录有效区域运动时间、有效区域运动距离、有效区域进入次数。Morris水迷宫训练完成后，C组于自制吸入麻醉箱中吸入1 L/min空气+1 L/min O230 min；实验组均吸入8%地氟烷30 min。C组、D-2组在分别吸入1 L/min空气+1 L/min O2和8%地氟烷30 min后完全苏醒2 h行Morris水迷宫实验并取材；D-12组、D-24组、D-72组于地氟烷麻醉完全苏醒后12、24、72 h再次行Morris水迷宫实验并取材。

1.4免疫荧光检测海马Aβ、Tau蛋白 Morris水迷宫实验结束当天，各组大鼠于各时间点分别腹腔注射1%戊巴比妥钠30 mg/kg，麻醉生效后处死，取海马组织石蜡包埋切片，待切片干燥后复水；抗原修复：将切片浸泡在抗原修复液中；过氧化物酶灭活：H2O2室温孵育；封闭；孵育一抗：将Tau和Aβ按1∶100稀释后滴加至组织上37℃ 2 h；孵育二抗：将兔二抗按1∶100稀释后滴加至组织上37℃ 1 h；染核：将Hochest染色液滴加至组织上室温15 min；脱水；在切片上滴加封片液(甘油和抗猝灭剂1∶1混合)；盖上盖玻片，封片；显微镜观察并拍照。

2 结 果

2.1行为学结果 麻醉前逃避潜伏期与总路程随着时间的推移逐渐缩短，第2～5天逃避潜伏期及总路程均显著短于第1天(P<0.01，P<0.05)，见表1。

表1 大鼠水迷宫训练逃避潜伏期与总路程

麻醉后各组有效区域运动时间、有效区域运动距离、有效区域进入次数差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 麻醉后各组大鼠空间探索实验结果的比较

2.2海马内Tau、Aβ蛋白表达比较 大鼠海马内Tau、Aβ蛋白的表达量各组间比较，差异无统计学意义(P>0.05),见表3、图1。

表3 各组海马Tau、Aβ蛋白表达比较

图1 免疫荧光法检测各组大鼠海马Aβ、Tau蛋白的表达(Hochest，×100)

3 讨 论

有关术后认知功能障碍(POCD)的发病机制目前仍不明确，研究已经表明，年龄是POCD的众多影响因素中唯一明确的危险因素，接受大手术治疗的老年患者POCD的发生率为30%～40%，部分患者可持续至3个月〔2〕，鉴于此，本次研究选择的研究对象为老年大鼠。

Morris水迷宫常应用于学习记忆脑机制研究，现已成为阿尔茨海默病基础研究中评价动物学习记忆的经典方法〔3〕。海马是脑内具有学习和记忆功能的重要结构，当大脑皮质中的神经元接收到各种知觉和感官讯息时，其会迅速将讯息传递给海马，海马损伤将导致大鼠学习记忆能力受损。过度磷酸化的Tau蛋白在脑内形成各种沉积物，沉积在神经元细胞内，引起神经元损害、变性。Aβ蛋白能在细胞基质中沉积并具有神经毒性，可激活小胶质细胞等促进神经元细胞凋亡，破坏神经系统。研究结果显示，Aβ过度沉积和Tau蛋白过度磷酸化是各种原因诱发学习记忆下降的共同通路〔4,5〕。

有关地氟烷麻醉对学习记忆能力是否造成影响报道不一致〔6～8〕。本研究根据前期的预实验结果选择8%地氟烷为研究使用浓度〔9〕。

本研究结果提示，老年大鼠吸入8%的地氟烷麻醉30 min后，学习记忆能力未出现下降。实验进一步通过对各实验组的大鼠海马内Aβ、Tau蛋白的检测发现，在各组大鼠海马和大脑皮层区域的Aβ、Tau蛋白表达高，其他部位表达近乎于无，与对照组相比较，各组间的蛋白表达呈现上升趋势，但差异不明显，表明大鼠海马内Aβ、Tau蛋白的表达尽管出现一定量的增加，但不足以对老年大鼠的空间学习记忆能力造成损害。Callaway等〔10〕的研究表明地氟烷对学习记忆能力的损害呈现剂量和年龄依耐性，老年大鼠在吸入最低有效肺泡浓度的地氟烷4 h，1 w后测试其学习记忆能力没有损害，与本研究结果一致。而与文献〔11〕的报道研究结果不一致，可能为研究使用的吸入药物浓度和麻醉时间不同所导致。

综上所述，使用地氟烷短时间麻醉影响大鼠海马内Aβ、Tau蛋白的表达增加，但未造成老年大鼠的短期学习记忆能力下降。有关地氟烷在认知功能方面的影响仍需进一步广泛且深入地开展相关研究，从而更好地为临床提供数据支持。