针灸对自然衰老围绝经期大鼠雌激素水平及单胺类神经递质的影响

权兴苗 王月 宋春侠 范丽洁 时菁静 刘玉兰 徐立伟

(1承德医学院附属医院中医科，河北 承德 067000；2河北中医学院)

围绝经期综合征(PMS)是由于生理或病理引起机体发生变化导致卵巢损伤或功能衰竭，使雌激素分泌减少，导致组织发生变化的退行性病变〔1〕。研究发现〔2〕，神经递质、激素和细胞因子失衡是PMS发生的主要原因，机体雌激素水平下降，影响单胺类神经递质的合成，可引发脑组织损伤，增加围绝经期抑郁症发生的风险。PMS的病因复杂，目前临床通常采用雌激素替代疗法治疗PMS，但长期使用雌激素会增加子宫内膜癌和乳腺癌发生的风险〔3，4〕。针灸治疗在神经和免疫等方面对全身具有宏观调控作用，具有安全、无痛、高效、快捷和适应性广等优点〔5〕。目前采用针灸治疗自然衰老围绝经期的机制研究尚浅，本研究主要通过自然衰老大鼠作PMS模型，观察针灸刺激双侧肾俞、三阴交和神门对大鼠脑组织去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(HT)、雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)水平的影响，探讨针灸疗法对围绝经期的神经保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 12～14月龄雌性SD大鼠30只，体重(300±20)g，阴道细胞涂片连续15 d监测未发现动情期变化，根据阴道分泌物和细胞学变化显示大鼠符合围绝经期变化规律〔6〕。同时选取健康4～6月龄雌性SD大鼠10只作为对照组，体重(220±20)g，均由河北省中西医结合医药研究院提供，合格证号：SYXK(冀)2014-0033。饲养室温(22±2)℃，湿度65%，自由摄食、饮水，适应性饲养1 w。

1.2主要试剂和仪器 E2、FSH、LH放射免疫分析试剂盒购自上海沪震生物科技有限公司；NE、DA和5-HT标准品购自美国Sigma公司。CKX53倒置生物显微镜(厂家：日本Olympus公司)；e2695型高效液相色谱仪(厂家：美国Waters公司)；life2720型PCR热循环仪(厂家：美国ABI公司)；DYCZ-30C型双板夹芯式垂直电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.3动物分组和给药 将30只大鼠随机分为模型组、阳性对照组和治疗组。将大鼠束缚，治疗组根据大鼠穴位图谱取双侧肾俞、三阴交和神门，肾俞位于第二腰椎后两旁，左右各一，刺入背阔肌、骼肋肌沟内，直刺6 mm；三阴交位于后肢内踝尖直上方1 cm，左右各一，刺入趾身屈肌，直刺5 mm；神门位于前肢内侧腕部横纹尺骨边缘，左右各一，刺入腕尺侧屈肌，之刺1 mm〔7〕；留针20 min，隔天1次，共15次，其余各组不进行刺激，但处理包括捆绑、脱毛等与实验组相同。阳性对照组灌胃给予尼尔雌醇1.5 mg/kg，1 d/次。其余各组给予等量生理盐水，1 d/次，连续4 w。

1.4旷场实验(OFT)测定行为学变化 OFT 取大鼠置于安静房间旷场反应箱(100 cm×100 cm×40 cm)，内壁涂黑，底面平均划分小格。记录大鼠在旷场内3 min 内穿越底面格数(四爪均进入方格方可计数)的水平活动得分(穿越1格计 1分，沿线行走每8 cm 计1分)及后肢直立次数(两前爪腾空或攀附墙壁)的垂直活动得分(双前足离地1次为1分)。

1.5大鼠卵巢组织苏木素-伊红(HE)染色 处死大鼠后摘取卵巢组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定，常规脱水，包埋，切片，片厚5 μm，常规脱蜡至水，苏木素染色10 min，0.5%盐酸乙醇分化2 s，伊红染色5 min，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，置于光学显微镜下观察卵巢组织黄体、卵泡和卵泡膜细胞等结构及形态学变化。

1.6放射免疫分析法测定E2、FSH和LH水平 各组大鼠末次治疗后禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血4 ml，室温静置30 min，3 000 r/min离心5 min，分离血清，测定E2、FSH和LH水平，实验步骤严格按照放射免疫分析试剂盒说明书方法进行。

1.7单胺类神经递质的测定 处死大鼠后迅速取脑，称重，加入2 ml 0.1 mol/L HClO4溶液，制作脑组织匀浆，于4℃下10 000 r/min离心10 min，取上清液作为供试品溶液。另取NE、DA和5-HT对照品适量，采用HPLC-ECD法测定混合对照品溶液峰面积，绘制标准曲线，取供试品溶液进样，计算含量。

1.8统计学分析 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组OFT水平及垂直运动得分比较 给药前，与对照组比较，模型组水平及垂直活动得分明显下降(P<0.05)。给药后，与模型组比较，阳性对照组和治疗组水平及垂直活动明显增加(P<0.05)；阳性对照组和治疗组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组水平及垂直活动得分比较分)

2.2各组卵巢组织形态学变化情况 对照组卵巢组织黄体发育良好，体积较大，可见多个成熟卵泡。模型组卵巢组织黄体数目少，成熟卵泡少，闭锁卵泡较多，表现为卵巢萎缩。阳性对照组和治疗组可见成熟卵泡，卵巢萎缩现象明显改善。见图1。

图1 各组卵巢组织HE染色结果(×400)

2.3各组单胺类神经递质含量比较 与对照组比较，模型组脑组织NE和DA含量明显降低，5-HT含量明显升高(P<0.05)。与模型组比较，阳性对照组和治疗组脑组织NE和DA含量明显升高，5-HT含量明显降低(P<0.05)；阳性对照组和治疗组脑组织NE、DA和5-HT含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2，表2。

图2 各组单胺类神经递质HPLC图

表2 各组血清NE、DA和5-HT含量比较

2.4各组性激素水平比较 与对照组比较，模型组血清E2水平明显降低，血清FSH和LH水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组和治疗组血清E2水平明显升高(P<0.05)，血清FSH和LH水平均明显降低(P<0.05)；阳性对照组和治疗组E2和FSH水平差异无统计学意义(P>0.05)，LH水平差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组血清E2、FSH和LH水平比较

3 讨 论

PMS在中医范畴里属于绝经前后诸证，认为是由于阴血亏虚，肾水不足，导致肾脏阴阳平衡失调引起病变〔8〕。肾为冲任之本，肾阴虚则精亏血少，肾阳虚则虚寒内生，对此，本研究通过刺激肾俞和三阴交，达到壮元阳，助运化的目的。肾俞穴归属足太阳膀胱经，有补肾助阳、调节生殖功能；三阴交属足太阴脾经，为足三阴经之汇，是调理肝脾肾的要穴，针灸二穴能够补肝益肾，调和营血〔9〕。神门系心气出入之门，为手少阴心经之腧穴，原穴，针灸神门可开心气，安定神智〔10〕。采用针灸刺激可激活相应的中枢神经系统，调控下丘脑-内分泌，继而影响靶器官。

卵巢是女性的性腺器官，具有排卵和产生雌激素、孕激素及雄激素的功能，卵巢功能衰退是围绝经期妇女卵巢分泌卵泡数量减少、性激素合成不足、血清雌激素水平下降的主要原因，激素水平下降会导致下丘脑和垂体等神经功能衰退，引起内分泌失调〔11，12〕。雌激素中以E2的活性最高〔13〕。在机体病理状态下E2分泌减少，会促进腺垂体和释放促性腺激素合成，引起内分泌功能紊乱，导致机体内环境异常，其中促性腺激素包括FSH和LH〔14〕。FSH具有促进卵泡的生长发育及生殖细胞成熟〔15〕，LH具有促进黄体酮分泌的作用〔16〕。单胺类神经递质的含量变化受到激素水平的影响，二者存在相关关系〔17〕，因此围绝经期妇女更容易出现心理疾病。本研究结果说明自然衰老大鼠血清雌激素分泌减少，会导致下丘脑-垂体-卵巢轴之间平衡失调，促进FSH及LH分泌。另外说明针灸刺激双侧肾俞、三阴交和神门，能够通过下丘脑-垂体-卵巢轴调节自然衰老围绝经期模型大鼠雌激素水平。此外，针灸刺激以上穴位能够刺激机体调节单胺类神经递质水平，起到一定抗抑郁作用。

综上，针灸双侧肾俞、三阴交和神门，能够调节自然衰老围绝经期模型大鼠雌激素水平，调节脑组织单胺类神经递质水平，改善围绝经期引起的抑郁行为。