基于P＆T-GC/MS的橘皮柠檬烯释放行为分析

黄 珂，许克静，陈 康，梁 淼，杨金初，张峻松*

（1 郑州轻工业大学食品与生物工程学院 郑州 450001 2 河南中烟工业有限责任公司 郑州 450001）

柑橘（Citrus reticulata Blanco），属芸香科类植物[1]，是中国重要的经济作物，具有较高的营养和药用价值[2]，被广泛应用于食品、香料、医药和化工等领域[3-4]。其主要成分为柠檬烯[5-7]，具有抗菌、抗氧化、抗癌、止咳平喘和抗炎等生理功能[8-10]，对乳腺癌、肝癌、结肠癌等均具有抑制作用，并能减轻各种癌症带来的损伤[11]。目前关于柑橘的研究也主要集中在柑橘精油提取、成分鉴定及功效分析等方面[12-17]，而对于橘皮中柠檬烯的释放行为的研究关注较少。橘皮中的柠檬烯不稳定[18-19]，挥发性强，释放较快，且释放行为易受外界条件（如光热）的影响，这些性质制约了其终端产品的应用。掌握橘皮中的特征香气成分释放行为，对于基于橘皮的产品加工与利用具有重要。

本文以橘皮为研究对象，采用吹扫捕集-气相色谱/质谱联用法（P＆T-GC/MS）联用技术建立橘皮中柠檬烯含量分析方法，研究柠檬烯的释放行为，以及外界条件（温度、时间）对释放行为的影响。采用动力学方程对释放行为进行拟合，获得动力学模型，以控制橘皮特征香味成分的释放，并为拓宽其应用范围提供参考。

1 材料、仪器与方法

1.1 材料与仪器

柑橘，江西赣南；柠檬烯（质量分数≥98%），百灵威科技有限公司。

SB-3200DT 超声萃取仪，宁波新芝生物科技有限公司；7890B/5977A 气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司；EL204 电子天平，Mettler-Toledo 仪器（上海）有限公司；EL204 吹扫捕集仪，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准工作溶液的配制 称取柠檬烯标准品0.03 g（精确至0.1 mg）于100 mL 容量瓶中，用水溶液定容刻度，得到柠檬烯质量浓度为0.3 mg/mL 的混合标准储备液。分别移取混合标准储备液10，20，30，40，50，60，80，100 μL 于100 mL 容量瓶中，加入水溶液定容刻度，得到质量浓度为0.03，0.06，0.09，0.12，0.15，0.18，0.2，0.3 μg/mL 的系列标准工作溶液。

1.2.2 吹扫捕集分析条件 吹扫捕集条件：吹扫气：高纯N2（纯度99.999%），吹扫流量40 mL/min；吹扫温度：70 ℃；吹扫时间：7 min；干吹时间：0.25 min；吹扫时捕集阱的温度：室温；解吸温度：250℃；解吸时间：2 min；烘焙温度：260 ℃；烘焙时间：2 min。

1.2.3 GC-MS 分析条件 色谱柱：HP-5MS（60 m×250 μm×0.25 μm）；进样口温度：280 ℃；分流比：5∶1；载气：He；流速：1.0 mL/min；升温程序：初始温度：40 ℃（10 min），4 ℃/min 升到250 ℃（20 min）。

电子轰击离子源（EI）源电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃，传输线温度：280 ℃，溶剂延迟：4.50 min。

1.2.4 样品前处理 将新鲜的柑橘用清水洗净，沥干，剥离柑橘果皮。将果皮放入烘箱中，温度45℃条件下热风干燥12 h，粉碎机粉碎，过筛得到40～60 目橘皮粉。准确称取0.03 g 橘皮粉置于500 mL 锥形瓶中，加入500 mL 纯净水，超声萃取30 min，用移液管移取10 mL 萃取液，迅速装入40 mL 吹扫捕集管中，然后装载到吹扫捕集仪中进行吹扫捕集-气相色谱-质谱联用分析。

1.2.5 不同温度下橘皮中柠檬烯释放 以橘皮为研究对象，按1.2.4 节方法进行样品前处理，设置9 个吹扫温度：40，45，50，55，60，65，70，75，80 ℃，每隔1 min（共65 min）记录捕集管中特征成分的释放情况。

1.2.5.1 释放量计算 根据公式（1）计算样品中柠檬烯的释放量H：

式中，Hn——前n min 柠檬烯释放量，mg/g；m1——第1 分钟柠檬烯检测值，mg/g；mn——第n分钟柠檬烯检测值，mg/g。

1.2.5.2 释放率计算 根据公式（2）计算柠檬烯在样品中柠檬烯的释放率Q：

式中，Qn——前n min 柠檬烯释放率，%；Hn——前n min 柠檬烯释放量，mg/g；H65——65 min 内柠檬烯释放量，mg/g。

1.2.5.3 柠檬烯释放行为动力学拟合 利用药物缓释动力学模型，对橘皮柠檬烯的释放行为进行动力学分析。常用的缓释模型有零级模型[20-21]、一级模型[22]和Higuchi 模型[23]。

式中，Q——样品中柠檬烯的释放率，%；t——橘皮的释放时间，min；k——释放速率常数；a——公式参数。

据上述零级模型、一级模型、Higuchi 模型对样品中柠檬烯的释放行为进行拟合分析，获得可较好描述释放行为的动力学模型，分析样品中柠檬烯在不同温度下的释放规律。同时利用阿伦尼乌斯公式（式6）计算反应活化能。

式中，k——温度T 时的释放速度常数；Ea——活化能，kJ/mol；T——绝对温度，K；R——摩尔气体常数，J/（mol·K）；A——指前因子。

以lnk 为纵坐标，1/T 为横坐标作图，通过直线的斜率（-Ea/R）计算反应活化能Ea，截距计算指前因子A。

1.2.5.4 半衰期的计算 柠檬烯释放一半时所需时间称为半衰期（T），由式（7）可得，一级反应的半衰期[24]为：

式中，T——橘皮的半衰期，min；k——释放速率常数。

2 结果与讨论

2.1 橘皮中香味成分分析

用P＆T-GC-MS 分析橘皮香味成分，检测结果总离子流图见图1，分析结果见表1。橘皮中主要香味成分为柠檬烯，占香味成分总量的95.01%。后续将柠檬烯作为橘皮的特征香味成分，对其释放行为进行研究。

表1 橘皮中香味成分分析结果Table 1 Analysis results of aroma components in orange peel

图1 橘皮中香味成分的总离子流图Fig.1 A total ion flow map of the scented ingredients in orange peel

2.2 吹扫捕集参数优化

2.2.1 吹扫流量 吹扫流量是P＆T-GC/MS 分析方法的关键因素，影响色谱峰的分离度、峰形以及捕集效率[25]。考察不同吹扫流量（10，20，30，40，50，60，70，80，90 mL/min）对样品中柠檬烯释放量的影响，结果见图2。当吹扫流量为40 mL/min 时，柠檬烯的释放量最高。最终选定吹扫流量为40 mL/min。

图2 吹扫流量对样品中柠檬烯释放量的影响Fig.2 The effect of purging flow on the release content of limonene in tangerine peel

2.2.2 解吸时间 通过改变解吸时间，确保各目标物质完全解吸进入色谱柱。分别设置解吸时间为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 min，考察不同解吸时间对样品中柠檬烯释放量的影响，结果如图3所示。当解吸时间为2 min 时，柠檬烯的释放量最大，说明柠檬烯的解吸较完全。最终选定解吸时间为2 min。

图3 解吸时间对样品中柠檬烯释放量的影响Fig.3 The effect of desorption time on the release content of limonene in tangerine peel

2.2.3 解吸温度 快速升温和重复性好的解吸温度是P＆T-GC/MS 分析方法的关键，影响方法的准确度和精密度[26]。考察不同解吸温度（210，220，230，240，250，260 ℃）对样品中柠檬烯释放量的影响，结果如图4所示。当解吸温度为250 ℃时，柠檬烯的释放量最大，继续增大解吸温度，柠檬烯释放量会有所下降。可能原因是解吸温度过高，导致吸附剂自身分解，缩短吸附剂的使用寿命。最终选定解吸温度为250 ℃。

图4 解吸温度对样品中柠檬烯释放量的影响Fig.4 The effect of desorption temperature on the release content of limonene in tangerine peel

2.2.4 吹扫时间 吹扫时间直接影响目标化合物的回收率[27]。考察不同吹扫时间（1～16 min）对样品中柠檬烯释放量的影响，结果如图5所示。当吹扫时间为7 min 时，柠檬烯的释放量最大，继续增大吹扫时间，柠檬烯释放量趋于平稳，说明吹扫时间7 min 时，柠檬烯的吹扫完全。最终选定吹扫时间为7 min。

图5 吹扫时间对样品中柠檬烯释放量的影响Fig.5 The effect of purging time on the release content of limonene in tangerine peel

2.2.5 吹扫温度 吹扫温度是影响检测效果的重要因素，如选择不合适，灵敏度和准确度会降低，分析时间变长，且不能将多种挥发性有机物完全分离[27]。考察不同吹扫温度（40，50，60，70，80 ℃）对样品中柠檬烯释放量的影响，结果如图6所示。当吹扫温度为70 ℃时，柠檬烯的释放量最大。最终选定吹扫温度为70 ℃。

图6 吹扫温度对样品中柠檬烯释放量的影响Fig.6 The effect of purging temperature on the release content of limonene in tangerine peel

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线、检出限和定量限 分别取系列标准工作溶液进行P＆T-GC/MS 分析，以横坐标为柠檬烯峰面积，纵坐标为柠檬烯的质量浓度，作柠檬烯的标准工作曲线，结果见表2。柠檬烯在0.06～0.30 μg/mL 质量浓度范围线性良好（R2≥0.9904），检出限为0.020 μg/mL。

表2 柠檬烯的线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantification limit of limonene

2.3.2 加标回收率与精密度 在橘皮中添加已知量的柠檬烯溶液，按照1.2.3 节和1.2.4 节的方法测定，平行测定5 次。如表3所示，样品中柠檬烯的平均回收率在96.97%～126.71%之间，精密度1.19%～4.70%（n=5），表明所建方法回收率较高，精密度良好，重复性好，可用于样品中柠檬烯释放量的测定。

表3 柠檬烯的回收率与精密度Table 3 Recovery and precision of limonene

2.4 不同温度下样品中柠檬烯释放行为分析

2.4.1 温度对样品中柠檬烯释放行为的影响 吹扫温度是影响柠檬烯释放量的重要因素，考察不同吹扫温度（40，45，50，55，60，65，70，75，80 ℃）下样品中柠檬烯的释放量随吹扫时间 （时间间隔5 min）的变化，结果如图7a所示。图7b 为前30 min内每隔5 min 柠檬烯释放增量，即柠檬烯释放的增速。可见，随着释放时间的增加，样品中柠檬烯释放量呈先快速增加后缓慢增加的趋势。0～10 min，样品中柠檬烯释放量快速增加，在设定温度范围随温度的增加，释放量在1.59～2.17 mg/g 范围呈升高趋势。吹扫温度越高，柠檬烯释放速率越快，这是由于环境温度升高，促进了柠檬烯分子的布朗运动，使柠檬烯释放的动能增大，释放速率加大。

图7 不同温度下样品中柠檬烯的释放量（a）及曲线斜率（b）Fig.7 Release content （a） and curve slope （b） of limonene in samples at different temperatures

10～20 min 内，样品中柠檬烯释放量增加的趋势减缓，对应释放量为0.20～0.66 mg/g。同时，该时间段柠檬烯释放速率明显降低，且随吹扫温度的提高，柠檬烯释放速率反而呈降低趋势。这可能是由于高温吹扫条件下，前10 min 内柠檬烯大量释放，使样品中柠檬烯含量过低所致。20～30 min，柠檬烯释放量由缓慢增加趋势逐渐过渡到基本持平，相应释放量为0.06～0.15 mg/g，表明前20 min内样品中柠檬烯基本完全释放。

计算各时间间隔下，样品中柠檬烯的释放率随温度的变化，结果见表4和图8。0～20 min，随吹扫温度的增加，柠檬烯释放率逐渐增大。例如：吹扫时间为5 min 时，吹扫温度从40 ℃增至80 ℃，释放率从28.93%增至72.10%。20～65 min，随吹扫温度增加，柠檬烯释放率缓慢增加，是由于是前20 min 样品中柠檬烯基本释放，柠檬烯质量浓度过低所致。另外，随着吹扫温度的提高，达到相同释放率的时间缩短。例如，柠檬烯释放率在80%以上，40～50 ℃时需15 min，55～80 ℃时需10 min；柠檬烯释放率在90%以上，40～50 ℃时需20～25 min，55～80 ℃时需15～20 min。

图8 不同吹扫温度下样品中柠檬烯的释放率Fig.8 Release rate of limonene in samples at different purging temperatures

表4 不同吹扫温度下样品中柠檬烯的释放率Table 4 Release rate of limonene in samples at different purging temperatures

2.4.2 不同温度下样品中柠檬烯释放动力学行为 采用药物释放的动力学方程：零级释放、一级释放、Higuchi 模型，对不同温度下样品中柠檬烯的释放过程进行拟合，比较不同动力学方程拟合的相关系数R2值，结果见表5。释放过程对不同模型的拟合度有一定差异，其中一级释放拟合效果最好，R2值最大，为0.906～0.997。这表明样品中的柠檬烯质量浓度对释放速率起关键性作用，是吹扫过程中释放的驱动力。

表5 各释放动力学方程对橘皮释放行为的释放拟合Table 5 The release fitting of each release kinetic equation to the release behavior of tangerine peel

对不同温度下柠檬烯的释放过程进行一级释放动力学拟合，结果如图9所示。计算不同温度下释放的半衰期，结果如表6所示。柠檬烯的释放速率常数和半衰期与吹扫温度关系密切，其中释放速率常数随温度的升高而增大，表明柠檬烯释放行为对温度敏感，温度越高，释放速度越快。同时，随着温度的上升，柠檬烯的半衰期逐渐变短。半衰期表明释放量达到一半时对应的时间。40 ℃时柠檬烯半衰期约为7.33 min，明显大于80 ℃时的半衰期（约2.22 min）。

表6 一级拟合下不同温度下橘皮微粉中柠檬烯释放的半衰期Table 6 The half-life of limonene released from orange peel micropowder at different temperatures under the first-order fitting

图9 一级释放模型拟合不同温度下样品中柠檬烯的释放Fig.9 The first-order release model fits the release of limonene in samples at different temperatures

活化能Ea是指在化学反应中，反应物达到活化分子所需的最小能量[28]。采用阿伦尼乌斯公式计算反应活化能，以lnk 为纵坐标，1/T 为横坐标作图。通过直线的斜率（-Ea/R）、截距（ln A）计算反应活化能Ea、指前因子A。结果见表7所示。从样品中释放柠檬烯的活化能为31.71 kJ/mol，指前因子为1.66×104。徐明月等[29-30]研究指出柑橘皮在不同干燥条件下活化能范围为10.39～28.10 kJ/mol，柠檬烯释放的活化能稍高于橘皮的干燥活化能，表明柠檬烯释放所需能量高于干燥能量。

图10 样品中柠檬烯释放率的lnk 对1/T 的线性拟合Fig.10 Linear fitting of lnk to 1/T of the release rate of limonene in the sample

表7 样品中柠檬烯释放的动力学参数Table 7 Kinetic parameters of the release of limonene in the sample

3 结论

利用P T-GC/MS 建立了样品中柠檬烯含量的检测方法。基于该方法考察不同温度条件下柠檬烯的释放行为，并用释放动力学方程对橘皮释放进行拟合，获得合适的动力学模型。结果表明：1）基于P＆T-GC/MS 联用技术的测定方法在0.06～0.30 μg/mL 范围线性良好，检出限为0.020 μg/mL，柠檬烯回收率96.97%～126.71%，精密度为1.19%～4.70%（n=5）。2）各试验温度下，随着释放时间的增加，样品中柠檬烯含量呈先快速增加后缓慢增加的趋势。0～10 min，样品中柠檬烯整体释放量较高，释放速率较快。10～20 min，样品中柠檬烯释放速率显著降低。20～65 min，样品中柠檬烯基本不再释放。3）不同温度下橘皮释放行为更符合一级释放模型，模型拟合相关系数R2值介于0.906～0.997 范围。