海棠茶水提物对黄嘌呤氧化酶的影响

王 宇， 汪鋆植，2*， 王丹阳， 聂淞莹， 张宏岐,2

(1.三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443002；2.湖北省生物酵素工程技术研究中心，湖北 宜昌 443002)

尿酸是人体内嘌呤代谢的终产物，在正常嘌呤饮食状态下当人体内尿酸值超过一定浓度(男性>420 μmol/L，女性>360 μmol/L)时，即发展为高尿酸血症[1]。黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)是嘌呤代谢的关键酶，可将黄嘌呤催化生成尿酸，因此以其抑制剂阻断尿酸合成是治疗高尿酸血症的有效方法之一，其中别嘌醇可有效抑制体内黄嘌呤氧化酶，使其不能被氧化成尿酸，从而达到控制尿酸水平的目的[2]，但不良反应较多，如史-约综合征(stevens-Johnson syndrome，SJS)、中毒性皮肤坏死症(toxic epidermal necrolysis，TEN)，死亡率达20%～25%[3]。因此，寻找安全性高、效果显著的黄嘌呤氧化酶抑制剂具有重要意义。

湖北海棠Malushupehensis(Pamp.) Rehder为蔷薇科苹果属植物，药食两用，海棠茶是其叶部位，也为三峡地区历史悠久的清凉饮料[4]，富含根皮苷、根皮素、三羟基根皮苷等黄酮类物质，以及齐墩果酸、熊果酸等三萜类化合物[5-6]，具有保肝护肝[7-8]、抗氧化[9]、降血糖[10]、抗病毒[11]等多种作用，但其对尿酸代谢的影响未见报道。有研究表明，高尿酸血症与糖尿病密切相关，相互促进[12]，鉴于海棠茶及其主要成分根皮苷具有降糖作用，本实验观察该药材对黄嘌呤氧化酶的影响，并对根皮苷、根皮素、三羟基根皮苷等黄酮类物质进行体外黄嘌呤氧化酶抑制活性研究，以期为其开发利用提供依据。

1 材料

1.1 试剂与药物 海棠茶由湖北省生物酵素工程技术研究中心(三峡大学)提供，经三峡大学王玉兵博士鉴定为湖北海棠Malushupehensis(Pamp.) Rehder的叶。根皮苷、根皮素、三羟基根皮苷纯度均大于95%，由湖北省生物酵素工程技术研究中心(三峡大学)提供。黄嘌呤(批号D1828210，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；氧嗪酸钾(批号C10652334，上海麦克林生化科技有限公司)；尿酸检测试剂盒(批号20200925)、黄嘌呤氧化酶检测试剂盒(批号20200630)(南京建成生物工程研究所)。

1.2 动物 70只昆明小鼠，雌雄各半，体质量(20±2)g，由三峡大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(鄂)2017-0012，实验动物使用许可证号SYXK(鄂)2017-0061，在温度20～26 ℃、相对湿度40%～70%下正常喂养，自由饮水。

1.3 仪器 JA2003型电子分析天平(上海天平仪器技术有限公司)；Infinite M200PRO酶联免疫检测仪(美国ATI公司)；Centrifuge 5415R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；KFS-C电子数字天平(永康市凯丰集团有限公司)；PH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；超纯水仪(美国Aquapro公司)。

1.4 药液

1.4.1 水提液 取海棠茶叶50 g，加10倍量水，在98 ℃下回流提取3次，抽滤，合并滤液，减压浓缩除去水分，真空干燥，即得。

1.4.2 底物溶液 1 mol/L氢氧化钠溶解黄嘌呤，加入30 mL蒸馏水，1 mol/L盐酸调节pH至7.5，即得(浓度为1.5 mmol/L)。

1.4.3 酶液 PBS缓冲液溶解XOD，即得(0.4 U)，在-80 ℃下保存，临用前稀释成不同浓度，并在冰水浴中保存。

1.4.4 样品溶液 DMSO溶解根皮苷、根皮素、三羟基根皮苷，即得，在4 ℃下保存，临用前稀释至不同浓度。

2 方法

2.1 黄嘌呤氧化酶活力测定 参考文献[13]报道并稍作修改，记录295 nm波长处每1 min增加的光密度(OD)值(ΔOD/min)来计算XOD活性。取样品、空白溶液各100 μL，0.1 U/mL酶液50 μL，依次加到96孔板中，在37 ℃下孵育5 min，加入0.05 mmol/L底物溶液，混匀，在295 nm波长处每隔15 s记录1次OD值，共监测5 min，计算抑制率，公式为抑制率={[(ΔOD/min)空白-(ΔOD/min)样品]/(ΔOD/min)空白}×100%，(ΔOD/min)空白为空白组反应速率，(ΔOD/min)样品为样品反应速率。

2.2 海棠茶水提物、根皮苷对高尿酸小鼠血尿酸的影响

2.2.1 分组、造模及给药 将70只小鼠按体质量随机分为空白组，模型组，别嘌呤醇组(5 mg/kg)，海棠茶水提物低、高剂量组(300、600 mg/kg)，根皮苷低、高剂量组(30、60 mg/kg)，每组10只。除空白组外，各组小鼠灌胃给予500 mg/kg氧嗪酸钾建立高尿酸血症模型，1 h后给药组灌胃给予相应药液；空白组、模型组灌胃给予等体积生理盐水，每天1次，连续14 d。末次给药1 h后，各组小鼠眼球静脉丛取血，3 000 r/min离心10 min，取血清，置于-20 ℃冰箱中保存。再脱颈椎处死小鼠，取肝脏组织，置于-80 ℃冰箱中保存。

2.2.2 小鼠血清尿酸水平和肝组织黄嘌呤氧化酶活性测定 取小鼠血清，按照尿酸检测试剂盒说明书检测尿酸水平。称取小鼠肝组织适量，按1∶9比例加入生理盐水，在-20 ℃下匀浆，制成10%匀浆液，2 500～3 000 r/min离心10 min，取上清液，按照相关试剂盒说明书检测黄嘌呤氧化酶活性。

2.3 黄嘌呤氧化酶抑制作用机制研究 参考文献[13-14]报道，保持反应体系中底物黄嘌呤浓度不变，设定XOD浓度分别为0、0.2、0.1、0.05、0.025 U/mL(0 U/mL为加等量PBS缓冲液)。以反应速率对酶活性作图，若得到平行直线，则为不可逆抑制；若所有直线均过原点，则为可逆抑制。

2.4 黄嘌呤氧化酶抑制类型和抑制常数测定 参考文献[13-14]报道，在黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶测活体系中保持酶浓度0.1 U/mL不变，设定黄嘌呤浓度分别为1、0.5、0.25、0.012 5、0 mmol/L(0 mmol/L为加入等量PBS缓冲液)。以酶的反应速率倒数为纵坐标，底物黄嘌呤浓度倒数为横坐标，采用以Lineweaver-Burk双倒数法作图，判断样品对XOD的抑制类型。

采用Dixon作图法，选取2个底物浓度，以抑制剂质量浓度为横坐标，反应速率倒数为纵坐标作图，得到2条相较于一点的直线，其交点处横坐标的绝对值即为抑制常数(Ki)。

2.5 根皮苷与根皮素对黄嘌呤氧化酶的联合抑制作用研究 参考文献[14]报道，采用等毒法，将根皮苷、根皮素对XOD抑制率为25%时所需的剂量混合，测定混合物对XOD的抑制率，以50%为预期抑制率，计算共毒系数，公式为共毒系数=[(实测抑制率-预期抑制率)/预期抑制率]×100%。当共毒系数大于10但小于20时，属于弱协同作用；大于20时，属于协同作用；小于-10时，属于拮抗作用。

3 结果

3.1 海棠茶水提物、根皮苷对小鼠血清尿酸水平、肝组织黄嘌呤氧化酶活性的影响 表1显示，空白组、给药组小鼠血清尿酸水平低于模型组(P<0.05)，给药组小鼠肝组织XOD活性低于模型组(P<0.05)，表明海棠茶水提物、根皮苷均具有体内XOD抑制活性，可有效降低小鼠血清尿酸水平，而且根皮苷可能为主要活性物质。

表1 海棠茶水提物、根皮苷对小鼠血清尿酸水平、肝组织黄嘌呤氧化酶活性的影响

3.2 海棠茶水提物及其所含成分对黄嘌呤氧化酶的抑制作用 表2显示，三羟基根皮苷对XOD的抑制活性最强，IC50值为(2.02±1.79) μg/mL；根皮苷、根皮素IC50值分别为(355.2±1.78)、(123.4±1.03) μg/mL，对XOD表现出较强的抑制活性；海棠茶水提物IC50值为(1 379±1.93)μg/mL，抑制活性不明显。

表2 海棠茶水提物及其所含成分对黄嘌呤氧化酶的抑制作用

3.3 根皮苷、根皮素、三羟基根皮苷对黄嘌呤氧化酶的抑制作用 图1～3显示，根皮苷、根皮素、三羟基根皮苷对XOD的抑制均为可逆抑制，均是通过降低酶活性来达到减少催化效率的目的。

图1 根皮苷对黄嘌呤氧化酶的抑制作用

图2 根皮素对黄嘌呤氧化酶的抑制作用

图3 三羟基根皮苷对黄嘌呤氧化酶的抑制作用

3.4 根皮苷、根皮素、三羟基根皮苷对黄嘌呤氧化酶的抑制类型及抑制常数

3.4.1 抑制类型 图4显示，随着根皮苷质量浓度升高，直线斜率逐渐增大，并相交于第一象限，属于混合型抑制。图5显示，随着根皮素质量浓度升高，直线纵轴截距基本不变，并相交于Y轴，属于竞争性可逆抑制。图6显示，随着三羟基根皮苷质量浓度升高，直线斜率基本不变，并相互平行，属于反竞争性可逆抑制。最终，选择IC50值相差不明显、均为竞争性抑制作用的根皮苷和根皮素进行后续研究。

图4 根皮苷对黄嘌呤氧化酶的抑制类型

图5 根皮素对黄嘌呤氧化酶的抑制类型

图6 三羟基根皮苷对黄嘌呤氧化酶的抑制类型

3.4.2 抑制常数 图7～9显示，根皮苷、根皮素、三羟基根皮苷对黄嘌呤氧化酶的抑制常数分别为411.04、80.05、3.0 μg/mL。

图7 根皮苷对黄嘌呤氧化酶的抑制常数

3.5 根皮苷、根皮素对黄嘌呤氧化酶的联合抑制作用 表3显示，共毒系数大于20，表明根皮苷与根皮素联用抑制黄嘌呤氧化酶活性时，具有协同作用。

表3 根皮苷、根皮素对黄嘌呤氧化酶的联合抑制作用

4 讨论

图8 根皮素对黄嘌呤氧化酶的抑制常数

图9 三羟基根皮苷对黄嘌呤氧化酶的抑制常数

高尿酸血症是由于尿酸的生成增多和/或排泄减少导致的代谢性疾病。本研究从尿酸生成途径检测了体外海棠茶水提物对尿酸生成关键酶——黄嘌呤氧化酶的抑制作用，并分析了其水提物中主要的黄酮类成分对黄嘌呤氧化酶的影响以及作用机理。结果显示，水提物中主要的黄酮类成分对黄嘌呤氧化酶活性具有抑制作用，其中三羟基根皮苷体外黄嘌呤氧化酶抑制活性极强，三羟基根皮苷在海棠茶中含量较高，可以深入研究。根皮苷和根皮素联合使用后对体外XOD抑制率达(73.75±2.18)%，表现出较强的协同作用，表明海棠茶水提物中不同抑制类型的不同成分通过对黄嘌呤氧化酶抑制的协同作用，使水提物具有更好的作用。

高尿酸血症与糖尿病密切相关，相互促进[12]，而海棠茶叶水煎液具有降血糖作用[15]。海棠茶中主要成分为根皮苷为钠葡萄糖协同转运蛋白(SGLT)抑制剂，Kimura等[16]报道，因SGLT抑制剂对SGLT2的抑制作用，导致肾集合管腔中葡萄糖浓度的增加刺激尿酸转运蛋白在近端小管中介导的尿酸排泄，并抑制肾脏收集管中的尿酸重吸收，从而降低血尿酸。有研究表明，根皮素可通过协同抑制NLRP3和尿酸重吸收，改善高尿酸性肾损伤，且具有降尿酸作用[17]。本实验结果显示，海棠茶水提物以及主要成分根皮苷等均可有效降低小鼠血清尿酸水平(P<0.05)，且可有效降低肝组织黄嘌呤氧化酶活性。因此，本课题组认为海棠茶对尿酸的体内代谢具有积极的意义，更适合2型糖尿病兼高尿酸血症患者饮用。海棠茶对调节尿酸代谢具有良好的应用潜景，但其对痛风的作用及机制有待进一步深入研究。

综上所述，海棠茶对黄嘌呤氧化酶具有抑制活性，主要活性成分为根皮苷等黄酮类成分。海棠茶对调节尿酸代谢，防治高尿酸血症，减少痛风风险具有积极作用。