喘贴灵巴布剂处方工艺优化及其体外透皮特性

李姿锐， 邹苏兰， 陆慧玲， 李 雅

(湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

支气管哮喘是常见的炎症性气道疾病，感染了世界上超过10%的人口[1-2]。虽然西医能有效控制症状，但其不良反应大，用药疗程长，患者顺应性差，停药后易反复发作，导致疗效不理想[3-4]。

喘贴灵由芥子、麻黄、细辛等8味药材组成，具有益气活血、补肺固肾作用，临床上将其穴位贴敷来治疗支气管哮喘，作用显著，可明显降低气道反应性，抑制炎症介质释放，延长哮喘潜伏期，从而改善哮喘气道变应性炎症[5-6]。巴布剂是一种新型透皮给药制剂，主要由水溶性高分子骨架材料、交联剂、保湿剂、填充剂、提取物等组成，具有避免肝脏首过效应、载药量大、与皮肤生物相容性好、透气、可反复贴敷，生物利用度高、药物透皮吸收效率高、减少胃肠刺激等优点，近年来受到大量科研工作者的重视，也成为国内外医药行业开发的热点[7-8]。本实验将喘贴灵制成巴布剂，并考察其体外透皮特性，以期为该制剂进一步开发利用提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent Technologies 1200 Series高效液相色谱仪，配置Agilent ChemStation色谱工作站(美国Agilent公司)；CZY-GY初黏力测定仪(济南兰光机电技术有限公司)；CP114电子天平[奥豪斯仪器(上海)有限公司]；DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)；TP-6智能透皮扩散仪(天津精拓仪器科技有限公司)；RE-2000A旋转蒸发器(巩义市中天仪器科技有限公司)；DZTW型调温电热套(北京市永光明医疗仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物 NP-700(昭和电工株式会社，批号931170A)；甘氨酸铝(上海麦克林生化科技有限公司)；聚乙烯吡咯烷酮K90(PVP K90)；氮酮(天津市瑞金物化学品有限公司，批号20190620)；甘油(国药集团化学试剂有限公司，批号20191014)；乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(湖南汇虹试剂有限公司，批号10180131)。细辛(批号20110412)、麻黄(批号20120806)、芥子(批号19070809)、丁香(批号20071605)、肉桂(批号20112103)、醋延胡索(批号20122306)、醋甘遂(批号19090404)均购自湖南振兴中药有限公司，经专家鉴定为正品。芥子硫氰酸盐(纯度98.3%，批号111702-202102)、盐酸麻黄碱(纯度100%，批号171241-20201)对照品(中国食品药品检定研究院)。所用试剂均为色谱纯；蒸馏水由湖南中医药大学模拟药厂提供。

2 方法与结果

2.1 浸膏制备 称取芥子30 g、麻黄20 g、细辛6 g、丁香20 g、肉桂20 g、延胡索20 g、甘遂20 g、生姜汁20 g，8倍量蒸馏水提取2次，提取时间分别为1.5、1 h，滤过，合并滤液，减压浓缩，即得。

2.2 巴布剂制备 称取处方量PVP K90，加入纯化水，水浴溶解10 min，作为A相；另取处方量的NP-700、甘氨酸铝混匀，再加入甘油和促渗剂，在60 ℃下搅拌6 min，作为B相；取处方量浸膏、EDTA、高岭土，溶于20 g水中，作为C相，将A相缓慢加到B相中，搅拌均匀，再加入C相，继续搅拌均匀，立即涂布于无纺布上，放置1 d，即得。

2.3 巴布剂质量评价

2.3.1 感官评分 参考文献[9]报道，以外观性状、涂展性、膜残留量、皮肤追随性、反复粘贴性为主观考察指标，总分40分，具体见表1。

表1 感官评分标准

2.3.2 初黏力 采用滚球斜坡停止法，板上有2条相隔10 mm的水平线，上线为钢球起始位置的标记，下线为供试品固定的标记。取巴布剂(10 cm×4 cm)，揭去防黏层，将上端固定在下线位置，黏性面向上，调节底座使钢板表面与水平面成30°倾斜，从大到小的顺序取钢球从水平线的上线自由滚落，记录巴布剂能黏住的最大钢球号，满分20分，其余与其相比依次评分。

2.3.3 持黏力 将巴布剂黏性面粘贴于试验板表面，垂直放置，沿长度方向悬挂1个规定质量的砝码，记录滑移直至脱落的时间，重复3次，取平均值，满分20分，其余与其相比依次评分。

2.3.4 剥离强度 取巴布剂(10 cm×4 cm)，揭去防黏层，粘贴于实验板表面，垂直放置，上端悬挂200 g砝码，记录脱落所需时间，重复3次，取平均值，满分20分，其余与其相比依次评分。

2.3.5 综合评分 根据2020版《中国药典》结合文献[10-11]报道，设定感官评分、初黏力、持黏力、剥离强度权重系数分别为0.4、0.2、0.2、0.2，计算综合评分，公式为综合评分=0.4*感官评分+0.2*初黏力+0.2*持黏力+0.2*剥离强度。

2.4 Plackett-Burman设计 在前期实验及预试验基础上，选择NP-700(A)、PVP K90(B)、甘氨酸铝(C)、EDTA(D)、甘油(E)、高岭土(F)用量作为影响因素，每个因素取1、-1水平，具体见表2，结果见表3。

表2 Plackett-Burman设计因素水平

表3 Plackett-Burman设计结果

通过Minitab软件对表2数据进行多元回归拟合分析，得方程为Y=36.6-4.15A+14.36B-41.1C+3.6D+1.066E+12.42F，结果见表4。由此可知，模型P<0.05，表明它具有显著性；相关系数R2为0.867 9，表明模型可较好地描述结果；各因素影响程度依次为E>A>F>B>C>D。

表4 Plackett-Burman方差分析

2.5 Box-Behnken响应面法 在Plackett-Burman设计基础上，确定甘油(A)、NP-700(B)、高岭土(C)用量作为影响因素，外观性状(D)、初黏力(E)、持黏力(F)、剥离强度(G)的综合评分作为评价指标，因素水平见表5，结果见表6。

表5 Box-Behnken响应面法因素水平

表6 Box-Behnken响应面法设计与结果

图1 各因素响应面图

表7 Box-Behnken响应面法方差分析

2.6 设计空间建立 根据Design-Expert 10.0软件所得数学模型，采用MODDE 12.1软件开发设计空间。由于巴布剂综合评分大于80分，故故设置其优化标准为80，最大限度为100。再通过Monte Carlo法获取基于达标概率的设计空间，首先进行仿真模拟实验，获得实验测定误差来计算达标概率，以综合评分满足优化标准时为达标，设置模拟次数为5 000次，结果见图2。由此可知，设计空间为绿色区域，该区域时中甘油、高岭土用量等条件的改变不会对巴布剂综合评分造成影响，数字表示工艺参数落在该范围内综合评分不能达到优化标准的概率，其值越小，颜色由红变绿，代表满足优化标准的可能性逐渐增加。最终确定，推荐的操作空间为甘油用量30～36 g，NP-700用量5～6 g，高岭土用量0.6～0.833 g。

图2 各因素设计空间

在设计空间范围内制备2份喘贴灵巴布剂(P1、P2)，测定各项指标，平行3次，计算综合评分，结果见表8。由此可知，该范围内所制备的巴布剂外观光洁有弹性，初黏力、持黏力良好。

表8 验证试验结果(n=3)

再对巴布剂载药性能进行考察，结果见表9。由此可知，载药量在10%～40%时性能较稳定，但低于10%或超过40%时综合评分明显降低。在不影响性能的前提下，应使巴布剂尽可能多地载药以确保疗效，故设定其最大载药量为40%。

表9 巴布剂载药性能考察结果

2.7 各成分含量测定

2.7.1 供试品溶液制备 精密称取巴布剂1.0 g，置于锥形瓶中，精密加入10 mL甲醇，超声处理30 min，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

1. 盐酸麻黄碱 2. 芥子碱硫氰酸盐图3 各成分HPLC色谱图

2.7.2 对照品溶液制备 精密称取盐酸麻黄碱、芥子碱硫氰酸盐对照品适量，甲醇溶解，制成分别含两者0.24、0.34 mg/mL的溶液，即得。

2.7.3 色谱条件 SinoChrom ODS-BP色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.08 mol/L磷酸二氢钾(0～40 min，10∶90)；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长210 nm。色谱图见图3。

2.7.4 线性关系考察 取“2.7.2”项下对照品溶液适量，甲醇稀释(盐酸麻黄碱质量浓度分别为0.001 67、0.005、0.012 5、0.025、0.033 mg/mL，芥子碱硫氰酸盐质量浓度分别为0.013 3、0.016 7、0.025、0.033、0.05 mg/mL)，分别精密吸取10 μL，在“2.7.3”项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积(Y)对其质量浓度(X)进行回归，得方程分别为盐酸麻黄碱Y=20 304X-21.03(r=0.999 2)，线性范围1.67～33.0 mg/mL；芥子碱硫氰酸盐Y=19 193X-250.24(r=0.999 5)，线性范围13.3～50 mg/mL。

2.7.5 精密度试验 精密吸取“2.7.2”项下对照品溶液(盐酸麻黄碱、芥子碱硫氰酸盐质量浓度分别为25.0、33.0 mg/mL)10 μL，在“2.7.3”项色谱条件下进样测定6次，测得盐酸麻黄碱、芥子碱硫氰酸盐峰面积RSD分别为 0.17%、0.43%，表明仪器精密度良好。

2.7.6 稳定性试验 精密吸取“2.7.1”项下供试品溶液，于0、0.5、1、1.5、3、6、12、24 h在“2.7.3”项色谱条件下进样测定，测得盐酸麻黄碱、芥子碱硫氰酸盐峰面积RSD分别为1.03%、0.59%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.7.7 重复性试验 精密称取巴布剂6份，按“2.7.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.7.3”项色谱条件下进样测定，测得盐酸麻黄碱、芥子碱硫氰酸盐含量RSD分别为1.58%、0.93%，表明该方法重复性良好。

2.7.8 加样回收率试验 精密吸取各成分含量已知的供试品溶液3 mL，共6份，分别精密加入80%、100%、120%水平对照品溶液，在“2.7.3”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，盐酸麻黄碱平均加样回收率为100.22%，RSD为1.13%；芥子碱平均加样回收率为99.78%，RSD为0.91%。

2.8 体外透皮实验 预实验选择氮酮、尿素、冰片、油酸、薄荷油作为透皮促渗剂[12]进行考察，发现氮酮、薄荷油对巴布剂的促透效果更优。本实验采用Franz扩散池法考察氮酮、薄荷油用量，HPLC法测定各时间点巴布剂君药(芥子、麻黄)中抗哮喘成分(芥子碱硫氰酸盐、盐酸麻黄碱)的渗透量。

2.8.1 透皮促渗剂用量选择 根据“2.6”项下优化操作空间，分别加入1%、3%、5%氮酮、薄荷油制备巴布剂。

2.8.2 离体大鼠皮肤制备 脱毛膏去除大鼠腹部毛发，正常饲养1 d后取皮，去掉皮下脂肪，生理盐水洗净黏液组织，即得，置于-20 ℃冰箱中冷冻保存，实验前自然解冻。

2.8.3 透皮实验 将“2.8.2”项下皮肤在37 ℃生理盐水中解冻，固定于Franz透皮扩散池上(接收池体积为20 mL，接收面积为7.065 cm2)，表皮层朝上面向供给池，真皮层朝面向接收池，排净气泡，将含有不同用量透皮促渗剂的巴布剂紧贴于皮肤上，接收介质为生理盐水，恒温(32 ℃)搅拌(300 r/min)，于 2、4、6、8、10、12、24 h取出接收介质各0.8 mL，同时向接收池中补充等温同体积生理盐水，0.45 μm微孔滤膜过滤，采用HPLC法测定盐酸麻黄碱、芥子碱硫氰酸盐含量，计算累积渗透量Qn，公式为Qn=(V总Cn+ΣCn-1V取)/A，其中V总为接收池体积(20 mL)，Cn为第n个取样点盐酸麻黄碱或芥子碱硫氰酸盐含量，Cn-1为第n-1个取样点盐酸麻黄碱或芥子碱硫氰酸盐含量，V取为取样体积(0.8 mL)，A为渗透面积(7.065 cm2)，累积渗透量-时间曲线见图4，再测定速率倍增系数(ER)、体外透皮速率(J)，结果见表10。

图4 各成分累积渗透量-时间曲线

表10 不同透皮促渗剂对巴布剂累积渗透量的影响(n=3)

由此可知，当不加入透皮促渗剂时，芥子碱硫氰酸盐体外透皮速率高于盐酸麻黄碱，而加入后2种成分体外透皮速率明显升高；氮酮促渗作用与其用量不成正比关系，当大于1%时2种成分促渗速率反而被抑制；薄荷油用量为3%时对盐酸麻黄碱的促渗效果最强，但与1%氮酮相比无明显差异，而且后者对芥子碱硫氰酸盐有显著促渗作用显著。最终，选择1%氮酮作为透皮促渗剂。

3 讨论

3.1 基质筛选 在基质处方设计中，NP-700为骨架材料，甘氨酸铝为交联剂，两者交联形成三维网状结构，使巴布剂具有较高的弹性和黏性[13]，其中PVP K90为增黏剂，EDTA为螯合剂，甘油为保湿剂，高岭土为无机填充剂，可调节其成型性、涂展性，增加膏体强度。同时，在制备C相的过程中利用高岭土结构疏松多孔，能吸附提取物中挥发油等油性物质的特性，将其与喘贴灵浸膏混合均匀，可提高其疗效[14]。

3.2 优化设计方法筛选 QbD理念强调增加对生产过程可靠控制，建立全方位易于开展的控制平台，有利于实际生产和操作[15-17]。本实验将该理念应用于喘贴灵巴布剂的工艺制备过程，结合Box-Behnken响应面法进行优化，构建了关键质量属性、关键工艺参数的工艺设计空间。在相关生产过程中，可根据实际情况对工艺参数在操作空间内进行调整，从而保障喘贴灵巴布剂的质量可控性。

3.3 体外透皮研究 喘贴灵中芥子、麻黄为君药，故本实验选择两者主要质量控制指标成分作为体外透皮试验检测指标，其中盐酸麻黄碱、芥子碱硫氰酸盐治疗哮喘疗效显著[18-21]。再考察了透皮促渗剂种类及用量，其中氮酮无味，无不良反应、性质稳定，可广泛用于促进透皮给药制剂的渗透中[22-24]，并且当其用量大于1%时麻黄碱、芥子碱透皮速率显著降低，表明促透作用并不随者用量增加而提高。