清肺口服液黄酮类成分改善RSV感染小鼠肺上皮屏障损伤的机制研究

凌晓颖,孙逊,李维峰，袁斌

(南京中医药大学附属医院,江苏 南京 210029)

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是全球婴幼儿、老年人和免疫功能低下人群病毒性肺炎最常见的病原体之一[1]。RSV在上呼吸道的上皮细胞中复制一段时间后,释放的病毒颗粒转移到下呼吸道的细支气管或肺泡,引起鼻塞、咳嗽、喘息,病情严重会出现呼吸窘迫、气道堵塞,甚至导致呼吸衰竭和死亡[2]。目前防治RSV感染的方式有限,尚无安全有效的抗病毒药物及批准用于临床的疫苗[3]。

肺泡上皮屏障主要由肺泡上皮Ⅰ型细胞、Ⅱ型细胞及细胞间的紧密连接(Tight junction, TJ)组成,是进行气体交换、抵御病原体入侵的重要免疫屏障[4]。紧密连接由蛋白质和脂类组成,其中蛋白质占主要地位,包括跨膜蛋白[紧密连接蛋白(Claudin)、闭合蛋白(Occludin)]和闭锁小带蛋白(Zonula occludens,ZO)等[5]。RSV主要靶向气道和肺泡上皮细胞,上皮细胞损伤后,相邻细胞的裂隙增大,细菌和炎症因子进入肺组织,放大局部和全身炎症[6]。因此,修复肺上皮屏障可能是防治RSV的重要方向。

RSV肺炎在中医古籍中虽无确切的病名记载, 但根据本病“喘、咳、痰、热”的四大症候特点，可将其归类于“肺胀”“马脾风”“肺家炎”等疾病范畴，急性期以痰热闭肺证最为多见[7]。全国名中医汪受传教授针对本病肺气郁闭的病机特点,在经方麻杏石甘汤基础上,加宣肺止咳之前胡,肃肺平喘之桑白皮,泻肺涤痰之葶苈子,解毒活血之虎杖等,组方制成以开肺化痰、解毒活血为主要功效的清肺口服液[8]。清肺口服液临床运用多年,能明显减轻RSV肺炎患儿咳嗽、发热等症状,疗效显著[9]。课题组前期研究发现,黄酮类成分是清肺口服液的主要效应物质,能够抑制RSV复制,减轻肺组织的炎症损伤[10]。最新网络药理学研究分析发现,丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路是清肺口服液黄酮类成分(Fla)治疗RSV肺炎的关键通路之一[11],p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)还被报道与RSV导致的上皮屏障损伤有关[12]。在RSV感染中,p38 MAPK的激活是由Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子88(MyD88)信号通路介导的[13]。因此本研究建立RSV感染小鼠模型,观察药物对紧密连接蛋白、TLR4/MyD88/p38 MAPK通路的影响,探究Fla保护肺上皮屏障的作用机制,也为清肺口服液的推广应用提供理论依据。

1 材料

1.1 RSV病毒

RSV A2型long株,购于中国典型培养物保藏中心,RSV在Hep2细胞上扩增,收集病毒备用。

1.2 动物

SPF级6～8周龄的雌性BALB/c小鼠购于斯贝福(北京)生物科技有限公司,许可证号:SCXK(京)2019-0010。动物实验获得南京中医药大学实验动物伦理委员会批准(201805A019)。

1.3 药物

清肺口服液按原比例配制:炙麻黄4 g,生石膏24 g,杏仁10 g,桑白皮10 g,葶苈子6 g,紫花前胡10 g,虎杖12 g,拳参12 g,制僵蚕6 g,丹参6 g,由江苏省中医院中药房提供。取药材5 kg粉碎,加12倍量85%乙醇回流提取3次,每次1.5 h,滤过,滤液合并,减压浓缩、冷冻干燥,获得冻干粉600 g,经聚酰胺树脂纯化后,减压浓缩、冷冻干燥获得Fla冻干粉,转移率为78.7%,并采用UPLC-MS/MS技术,定量检测出儿茶素、木犀草素等26种黄酮类化合物[11]。利巴韦林(批号：B27035,HPLC≥98%)购自源叶生物有限公司。

1.4 试剂

伊红染料、苏木精染料(Sigma,批号:170、H9627);FITC-葡聚糖(源叶生物，批号：S26605)；RIPA裂解液、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液、Tris-Glycine SDS电泳缓冲液、快速转膜液(新赛美,批号: WB3100、P002、WB52001、WB4600);SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天,批号：P0012A);小鼠白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA 试剂盒(南京谨庭，批号：JTE79825、JTE79147);Claudin-1、TLR4抗体(Abmart,批号：PA2349、TA7017);Occludin、ZO-1、p38 MAPK、MyD88抗体(Proteintech,批号：27260-1-AP、21773-1-AP、14064-1-AP、23230-1-AP);p-p38 MAPK、β-肌动蛋白(β-actin)抗体(Affinity,批号：AF4001、AF7018)。

1.5 仪器

BioPhotometer D30蛋白核酸分析仪(Eppendorf);MM400混合球磨仪(Retsch);Power Pac Basic电泳仪、Trans-blot-SD转膜仪、Chemi-Doc MP凝胶成像系统(Bio-Rad);Infinite 2000酶标仪(TECAN);Axio Scope A1光学显微镜(Carl Zeiss)。

2 方法

2.1 模型建立和给药

30只BALB/c小鼠适应性饲养1周后,随机分为空白组、模型组、Fla高剂量组(60 mg·kg-1·d-1)、Fla低剂量组(30 mg·kg-1·d-1)、利巴韦林组(46 mg·kg-1·d-1),每组6只。除正常组外,其余小鼠于实验第1天,在异氟烷麻醉状态下予1×107pfu·mL-1的RSV病毒液80 μL滴鼻,构建RSV感染小鼠模型[11]。给药组分别予0.5% CMC-Na生理盐水溶解的Fla或利巴韦林灌胃,持续给药4 d;空白组和模型组灌胃等量0.5% CMC-Na生理盐水。末次给药后禁食不禁水,于第2天处死小鼠,取样备用。

2.2 肺组织HE染色

取每组小鼠新鲜肺组织,加入4%多聚甲醛固定24 h,石蜡包埋、切片、脱蜡,使用HE染色,于光学显微镜下观察肺组织炎症情况,并进行炎症评分[11]。

2.3 肺上皮通透性检测

肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量测定：使用BCA定量法测定BALF中蛋白含量。依次加入10 μL稀释好的BALF与200 μL的BCA工作液，37 ℃ 孵育30 min，酶标仪562 nm波长下检测OD值，计算蛋白含量。

BALF/血清荧光比测定：FITC-葡聚糖是一种荧光素-异硫氰酸酯葡聚糖标记物，可用于检测上皮通透性。在小鼠处死前1 h，使用0.2 mg 4 kDa FITC-葡聚糖灌胃，处死后取BALF和血清。设置发射波长为492 nm，接收波长为520 nm，检测荧光板读数板中BALF和血清的FITC-葡聚糖含量。

2.4 ELISA法检测BALF中IL-1β和TNF-α的含量

取小鼠BALF,按照试剂盒说明,检测IL-1β和TNF-α的含量。

2.5 Western blot法检测紧密连接表达相关蛋白

称取20 mg肺组织，加入200 μL RIPA裂解液和20 μL蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液混匀,研磨匀浆,提取肺组织的总蛋白,使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量,等量蛋白加样,依次进行电泳、转膜、封闭。Claudin-1(1∶1 000)、Occludin(1∶3 000)、ZO-1(1∶3 000)、p38 MAPK(1∶1 000)、p-p38 MAPK(1∶1 000)、TLR4(1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)特异性抗体4 ℃孵育过夜,第2天回收清洗,加入与一抗同源的二抗室温孵育1 h,使用ECL发光液显影,并对目的条带进行成像分析。

2.6 统计学分析

3 结果

3.1 Fla对RSV感染小鼠肺组织病理的影响

正常组小鼠肺组织结构清晰完整,未见明显出血和炎症浸润。模型组小鼠肺组织出现明显病理改变,表现为充血、水肿,肺间质增厚,伴有明显的炎性细胞浸润(P<0.01);而Fla高、低剂量组及利巴韦林组均能显著改善上述病理特征(P<0.05,P<0.01)。见图1。

注：与正常组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。±s，n=6。

3.2 Fla对RSV感染小鼠肺上皮通透性的影响

肺上皮屏障损伤是RSV病情进展的重要因素,上皮通透性是评价屏障功能的主要指标。图2结果显示模型组小鼠表现出更高的BALF蛋白含量和增加的BALF/血清荧光比(P<0.01),表明RSV感染导致肺上皮屏障的破坏。而Fla高、低剂量组及利巴韦林组的BALF蛋白含量和BALF/血清荧光比显著降低(P<0.01),说明Fla能降低肺上皮的通透性,维持上皮屏障稳定。

注：与正常组比较,##P<0.01;与模型组比较,**P<0.01。±s，n=6。

3.3 Fla对RSV感染小鼠BALF中炎症因子的影响

肺上皮通透性增加,有利于炎症因子的产生与释放,而炎症因子又会进一步损伤上皮屏障，因此我们检测了BALF中IL-1β和TNF-α的含量。如图3所示,与正常组相比,模型组BALF中IL-1β和TNF-α的蛋白水平显著上升(P<0.01),而高、低剂量的Fla均能有效降低上述炎症因子的水平(P<0.05，P<0.01),说明Fla有较好的抗炎作用。

3.4 Fla对RSV感染小鼠肺组织紧密连接关键蛋白的影响

与正常组相比,模型组小鼠肺组织紧密连接关键蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1表达明显减少(P<0.01),而Fla高、低剂量组及利巴韦林组均能提高上述蛋白的表达(P<0.05，P<0.01)，见图4。结果说明,Fla可以通过提高紧密连接蛋白表达水平,减轻RSV导致的肺上皮屏障损伤。

注：与正常组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。±s，n=3。

3.5 Fla对RSV感染小鼠TLR4/MyD88/p38 MAPK的影响

Western blot结果显示,模型组小鼠肺组织中TLR4、MyD88、p-p38 MAPK/p38 MAPK水平明显增加(P<0.01),而Fla抑制了肺组织中TLR4、MyD88的表达和p-p38 MAPK/p38 MAPK(P<0.05，P<0.01)。提示Fla可能通过抑制TLR4/MyD88/p38 MAPK通路,保护上皮屏障,减轻炎症反应。见图5。

注：与正常组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。±s，n=3。

4 讨论

RSV严重威胁人类健康,尤其是对婴幼儿、老年人及免疫功能缺陷患者,每年造成巨大的经济损失。目前批准用于RSV预防和治疗的药物分别是帕利珠单抗和利巴韦林[3]。但两者均仅适用于RSV感染的高危患者,在疗效和安全性方面也存在争议[14-15]。中医认为,RSV肺炎病位主要在肺,热、郁、痰、瘀是本病的主要病理因素。小儿肺常不足,外感风寒或风热,入里化热,炼液为痰,痰瘀互结,郁闭肺络,肺气闭塞,出现喘嗽之症。清肺口服液组方药物包括麻黄、生石膏、杏仁、桑白皮、葶苈子、紫花前胡、虎杖、拳参、僵蚕、丹参,全方宣肃肺气、清热解毒、化痰泄浊、活血通络,正契合本病痰热闭肺证的病机。多项临床研究试验证明清肺口服液是治疗RSV肺炎的安全有效药物[9,16]。在本实验中,模型组小鼠的肺组织病理充血水肿、肺间质增厚,伴有炎性细胞浸润,提示该模型构建成功,Fla高、低剂量组均能减轻上述病理损伤,对RSV感染小鼠具有显著治疗作用。

紧密连接蛋白是肺泡上皮屏障的重要组成部分,对于调节气体交换、液体转运,阻止有害物质侵入肺组织有着重要意义[17]。Claudin作为重要的跨膜蛋白,是构成细胞膜紧密连接的重要成分。Occludin进入紧密连接复合体后,能降低细胞膜的通透性,仅容许小分子物质进出。ZO-1可将细胞骨架和蛋白质连接固定在细胞膜的特定区域,维持细胞的屏障功能[18]。先前研究表明,RSV感染后,小鼠肺组织上皮屏障损伤,伴随着紧密连接蛋白的降解和炎症因子的释放[6]。IL-1β和TNF-α是重要的促炎介质,不仅能促进RSV诱导的肺部炎症进展[19],还能下调ZO-1蛋白表达,加重紧密连接破坏[20],而上皮屏障损伤又会进一步加重炎症反应,形成恶性循环。本研究中Fla不仅能抑制RSV感染小鼠BALF中炎症因子IL-1β和TNF-α的水平,还能上调Claudin-1、ZO-1和Occludin的蛋白表达,降低肺上皮通透性。这些结果证明Fla具有改善炎症和保护上皮屏障的功效。

RSV融合蛋白结合TLR4后,衔接蛋白MyD88通路被激活,经过细胞内一系列信号传导,进而激活p38 MAPK通路[13,21],介导后续的炎症反应和上皮屏障损伤[12,22]。文献报道RSV感染后,上皮细胞中的TLR4水平显著升高,而TLR4的敲除抑制了p38 MAPK信号的传导,证明RSV感染中p38 MAPK的激活是TLR4依赖的[23]。p38 MAPK抑制剂 NJK14047不仅能抑制RSV病毒复制,还能降低炎症因子IL-6水平[22]。p38 MAPK抑制剂SB28350被证实能够调节细胞骨架,降低RSV感染后上皮细胞的通透性,从而保护上皮屏障[12]。在亚砷酸盐诱导肺损伤的体内外模型中,SB28350能够提高Occludin的蛋白水平,改善紧密连接结构和肺上皮屏障损伤[24]。这些研究结果提示阻断TLR4/MyD88/p38 MAPK激活可能是改善紧密连接和炎症反应的潜在治疗方法。本研究Western blot结果显示,Fla能够降低TLR4、MyD88的蛋白表达以及p38 MAPK的磷酸化,提示Fla对RSV感染的改善作用可能是通过TLR4/MyD88/p38 MAPK信号通路实现的。

综上,Fla可能通过抑制TLR4/MyD88/p38 MAPK信号通路,增加紧密连接蛋白表达,抑制炎症因子释放,从而缓解RSV导致的肺部炎症和上皮屏障损伤。