葡聚糖硫酸钠诱导小鼠空肠损伤及肠上皮细胞组成变化的研究

匡雁玲，万志成，李 佩，陈钦亮，杨彩梅，刘金松，刘玉兰，王 丹*

（1.武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023；2.浙江惠嘉生物科技股份有限公司，浙江安吉 313307）

肠道作为机体与外界接触面积最大的器官，其健康状况对机体至关重要。肠道主要由肌肉层、黏膜层以及覆盖于黏膜层上的肠上皮构成。肠上皮由肠道干细胞不断增殖分化而来的各种功能细胞组成，包括肠吸收细胞、内分泌细胞、杯状细胞和潘氏细胞等。肠道具有消化吸收作用——消化食物、吸收营养物质，运输电解质和分泌蛋白质等用途，维持机体的内环境稳态。此外，肠道还构成一道具有免疫作用的屏障来防御有害物质入侵机体。据报道，肠道各种功能细胞组成的改变与肠道炎症性疾病（炎症性肠病、肠应激综合征等）的发生以及如脓毒症和败血症等消化道疾病的发生密切相关。因此，研究肠道损伤后，肠道各种功能细胞的组成变化对预防各种肠道疾病具有十分重要的意义。

研究表明，葡聚糖硫酸钠（DSS）会诱导小鼠结肠炎，导致小鼠肠道黏膜和组织损伤。炎症性肠炎（IBD）小鼠肠道干细胞增殖活性会下降，并会使得肠道干细胞向杯状细胞和潘氏细胞等分泌型细胞分化。同样，相关研究也报道DSS 诱导小鼠第7 天后结肠中会出现异常分化的潘氏细胞，其分泌的防御素表达上调，而杯状细胞无显著影响。目前的研究主要是探究DSS 诱导小鼠结肠炎后破坏肠道屏障，并对肠道干细胞增殖分化造成的影响。空肠作为机体胃肠道的前端，在DSS 诱导下其是否也会发生炎症反应并影响肠上皮细胞的组成目前还不明确。因此，本试验旨在研究DSS 诱导小鼠损伤后，空肠组织形态学、ATP 含量、炎性因子表达以及肠上皮细胞组成的变化。

1 材料与方法

1.1 试验材料 12 只体重（21.74±1.05）g 的6 周龄雄性SPF 级C57BL/6 小鼠购自北京贝恩特生物科技有限公司。DSS 的分子量为6 000～50 000，购自MP Biomedicals 公司。

1.2 试验设计 本试验将12 只小鼠随机分为对照组和DSS 组，每组6 只，组间体重无明显差异，饲喂基础日粮，自由饮水，室温25℃，光照/黑暗时间设置为12 h/12 h。适应期2 周后开始正式试验。对照组继续饮用纯净水，而DSS 组则饮用添加了2.5% DSS 的纯净水。第8 天，小鼠禁食4 h 后称重处死，取空肠前端约1 cm 2 份，分别置于4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中固定，然后收集空肠组织放于-80℃待测。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 代谢表型 每天在同一时间点观察小鼠的行为情况及体况，记录腹泻情况、观察粪便及肛门出血情况，并记录体重。根据小鼠体重、粪便形态以及出血情况进行疾病活动指数（DAI）评分表1。

表1 疾病活动指数（DAI）评分标准

1.3.2 组织形态学分析

1.3.2.1 HE 染色分析 将固定于4% 多聚甲醛的空肠组织样品制成HE 染色切片，然后在光学显微镜下观察空肠的组织形态。具体制备方法及形态学指标的测定参照Liu 等。

1.3.2.2 透射电镜分析 将固定于2.5% 戊二醛的空肠组织样品，通过处理后进行电镜观察，具体测定方法参照华洪葳。

1.3.3 空肠组织中ATP 含量的测定 空肠组织中ATP 含量测定具体方法根据试剂盒说明书来进行操作，试剂盒购买于碧云天生物技术有限公司。

1.3.4 空肠组织中炎性细胞因子、肠道干细胞和各种功能细胞标记基因的表达量测定 炎性细胞因子包括肿瘤坏死因子-（）、白细胞介素-1（）、白细胞介素-6（）；肠道干细胞标记基因包括亮氨酸重复序列 G 蛋白偶联受体5（）、无刚毛鳞甲复合体样蛋白2（）；肠道功能细胞标记基因包括分泌黏蛋白（）、碱性磷酸酶（）、溶菌酶（）的mRNA 表达量用Real-time PCR 技术分析，以为内参基因，采用Livak的2法进行计算。所需试剂购自TaKaRa 公司，引物序列见下表2。

表2 引物序列

1.4 统计分析 数据分析采用SPSS 17.0 统计软件进行分析，结果用平均值± 标准误表示。采用独立样本T 检验分析2 个处理组间差异，以<0.05 表示差异显著，<0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 DSS 处理对小鼠体重、腹泻分数及疾病指数的影响如图1 所示，与对照组相比，DSS 组小鼠肛门出血和体重降低，其中第5 天体重显著降低，第6、7、8 天体重极显著降低；与对照组相比，DSS 组小鼠的腹泻分数和疾病指数均在第5 天开始出现极显著差异。

图1 DSS 处理对小鼠代谢表型影响

2.2 DSS 处理对小鼠的空肠组织形态结构的影响 如图2 和表3 所示，对照组小鼠空肠的隐窝-绒毛轴结构完好，而DSS 组小鼠空肠的隐窝-绒毛轴结构严重受损。与对照组相比，DSS 组空肠的绒毛高度/隐窝深度极显著降低，其中绒毛高度极显著降低，而隐窝深度差异不显著。

表3 DSS 处理对小鼠空肠形态学的影响

图2 DSS 处理小鼠空肠HE 染色结果（100×）

2.3 DSS 处理对小鼠空肠中炎症细胞因子相对mRNA 表达的影响 如表4 所示，与对照组相比，DSS 组小鼠空肠组织中的炎性因子、、的mRNA 的表达量均显著提高。

表4 DSS 处理对小鼠中空肠中炎症因子的mRNA 表达的影响

2.4 DSS 处理对小鼠空肠上皮超微结构的影响 如图3所示，对照组小鼠空肠上皮细胞均未发生明显损伤，表现为微绒毛紧密排列，紧密连接正常，线粒体正常。然而，DSS 组小鼠的空肠上皮细胞超微结构受损呈微绒毛略有稀疏，紧密连接略有模糊，且存在少部分的线粒体固缩等现象。

图3 DSS 处理对小鼠空肠上皮超微结构的影响（Hitachi TEM system，×2.5 K）

2.5 DSS 处理对小鼠空肠中ATP 含量的影响 如图4 所示，与对照组相比，DSS 组小鼠空肠中ATP 含量极显著降低。

图4 DSS 处理对小鼠空肠中ATP 含量的影响

2.6 DSS 处理对小鼠空肠肠道干细胞以及各种功能细胞标记基因的影响 如表5 所示，与对照组相比，DSS 组小鼠空肠干细胞的标记基因及杯状细胞的标记基因的相对mRNA 表达量显著降低，肠吸收细胞的标记基因的相对mRNA 表达量极显著降低，潘氏细胞的标记基因的相对mRNA 表达量有显著降低的趋势（=0.061）。

表5 DSS 处理对小鼠空肠中肠道干细胞和各种功能细胞标记基因mRNA 表达的影响

3 讨论

肠道在受不同的外源因素（细菌、内毒素、病毒等）影响下，会造成肠道黏膜损伤，肠道屏障功能破坏，内环境稳态失衡，进而发生肠炎。研究表明，给小鼠饮用含DSS 的纯净水会促使肠道发生时间依赖性炎症反应，从而造成小鼠肠道损伤。DSS 主要通过刺激机体产生过量的炎性细胞因子（、、等），激活NF-B 信号通路，进而激活下游靶基因产生促炎介质，诱导肠道发生炎症反应。因此，本试验采用DSS 来构建小鼠的肠道损伤模型，以研究DSS 诱导的肠道损伤与空肠线粒体代谢和各种功能细胞组成变化的相关性。

研究表明，小鼠受到抗生素或者其他药物刺激后，小鼠的代谢表型变化是最为直接的，包括采食量、体重、DAI 等。因此实验中常用小鼠的体重情况和DAI 评分来评估其具体病情。Kuprys 等研究发现，DSS 诱导小鼠体重显著下降、结肠显著缩短，DAI 显著升高。这与本试验结果类似，DSS 组小鼠体重显著降低，严重者可观察到肛门出血，且腹泻指数和DAI 显著升高。小鼠体重降低可能是由于饮水中添加DSS 降低了小鼠饮水量和采食量；而肛门出血和腹泻比例增加可能是由于DSS 诱导了结肠炎性细胞因子的升高以及破坏了结肠的屏障功能。

肠黏膜形态可以反映肠道屏障的完整性，常通过绒毛高度和隐窝深度来评价其受损程度。本试验结果表明，DSS 组小鼠空肠的隐窝-绒毛结构受损，且绒毛高度显著降低。Zhou 等研究发现，呕吐毒素刺激会诱导小肠的绒毛高度和隐窝深度降低。综上所述，推测DSS 刺激破坏了小鼠空肠黏膜屏障，并且可能伴有炎症。

研究发现，LPS 刺激会导致空肠炎性因子、、的表达上调。Qin 等研究发现，DSS诱导小鼠结肠炎会伴随着结肠中炎性细胞因子（、、）表达增加，这与本试验结果一致，即DSS 处理会诱导小鼠空肠组织中的炎性因子、和的mRNA 表达量显著升高。推测可能是因为DSS 诱导肠道屏障的通透性以及离子转运的渗透性发生改变，造成肠道损伤。

肠道上皮的完整性是抵御外界环境中细菌和病毒等入侵机体的关键。本研究通过电镜观察肠道上皮结构发现，DSS 组小鼠空肠上皮细胞微绒毛的排列略有稀疏，紧密连接略有模糊，且存在少部分的线粒体固缩等现象。线粒体作为产生ATP 的关键场所，因此我们推测DSS 可能影响空肠中ATP 的含量。试验结果表明，DSS 组小鼠空肠中ATP 含量减少，这可能是因为DSS破坏了线粒体形态，降低了线粒体膜电位，影响了线粒体发生氧化磷酸化反应。Cao 等研究表明，LPS 诱导仔猪肠道损伤时会伴随小肠线粒体能量代谢紊乱，这与本试验结果类似。

肠上皮细胞的完整性是肠屏障功能的基础。肠道干细胞主要参与肠道的自我更新和维持肠道内环境稳态。肠道干细胞增殖分化产生各种功能细胞，成熟并迁移至绒毛顶端来发挥作用。潘氏细胞主要位于小肠隐窝中，能够分泌溶菌酶（）、防御素等来抵御内源性微生物刺激肠上皮，从而起到保护肠道屏障的作用，还能够产生微环境为肠道干细胞提供生态位以维持其自我更新。杯状细胞是一种分泌型肠上皮细胞，能够分泌黏蛋白（）来防止外源因素对肠道屏障的损害。肠吸收细胞是肠道功能细胞中数量最多的一类细胞，主要参与机体对营养物质的消化吸收。Khaloian 等研究发现，克罗恩病（CD）小鼠中Lgr5ISC 表达减少，且其分化异常，产生大量潘氏细胞。本试验结果发现，DSS 组小鼠空肠中肠道干细胞的标记基因和杯状细胞的标记基因的表达显著降低，肠吸收细胞的标记基因的表达极显著降低，潘氏细胞的标记基因的表达有显著降低的趋势。以上结果说明DSS 处理降低了小鼠空肠中肠道干细胞及各种功能细胞数量。Davidson 等研究结果显示，DSS 诱导小鼠结肠肠道干细胞数量降低。综上，DSS 处理降低了空肠中肠道干细胞数量，并且可能抑制了肠道干细胞向各种功能细胞分化，具体机制有待进一步研究。

4 结论

本试验结果显示，DSS 刺激诱导小鼠空肠发生炎症反应，造成肠道损伤，降低了空肠中肠道干细胞和各种功能细胞的数量。