胆固醇7-羟化酶基因rs4738687多态性与乙型肝炎病毒感染的相关性研究

陈学兵，欧世梅，张利沙

乙型肝炎病毒（HBV）感染属于全球性健康问题，研究发现目前世界范围内近20亿人感染过HBV，但是病人临床结局存在较大差异，一般取决于HBV持续感染性以及病人康复状态，HBV感染病人发生发展对于指导病人治疗以及改善预后具有重要意义，因此如何有效的评价病人病情进展一直是临床关注的热点［1］。研究显示宿主因素主要是宿主基因单核苷酸多态性是影响HBV感染与疾病发展的重要因素，既往研究发现钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白为肝细胞表面胆汁酸受体，也是HBV感染肝细胞受体，介导病毒进入到肝细胞，HBV则可以同胆汁酸竞争性结合，胆固醇7-羟化酶（cholesterol 7 alpha hydroxylase，CYP7A1）属于胆汁酸生物合成途径重要的限速酶，具有分解胆固醇变为胆汁酸能够维持肝细胞脂质稳定的功能，有研究发现HBV能够结合钠离子-牛磺胆酸抑制胆汁酸进入到肝细胞，造成了该基因表达升高，促进了人体胆固醇转变为胆汁酸导致肝细胞被破坏，但是临床对于CYP7A1基因多态性对于HBV感染的相关性临床分析极为少见［2］。本研究分析了CYP7A1基因rs4738687多态性与HBV感染的相关性，目的是分析该基因多态性同HBV病人临床结局之间的关系，对HBV病人发病机制进行探讨，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料回顾性选取2015年1月至2019年2月在德阳市人民医院治疗的HBV感染病人（观察组），纳入标准：①诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》［3］中的标准；②入院前未接受抗病毒治疗；③病人及近亲属知情同意。排除标准：①有其他病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝病等其他肝脏病变；②有HIV感染。最终纳入200例（观察组），其中慢性HBV感染者140例，HBV肝硬化病人60例。同时选取该院健康体检者120例作为对照组，两组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》中的相关要求。

表1 观察组（乙型肝炎病毒感染病人）和对照组（健康体检者）一般资料比较

1.2实验方法抽取病人空腹静脉血3 mL，取200μL全血采用TIANamp基因组DNA试剂盒提取全血DNA，采用Haploview 4.2软件对CYP7A1 rs4738687位点进行筛选，采用改进多重高温连接酶检测反应技术进行基因分型，PCR循环程序为95℃2 min，11个循环（94℃20 s，65℃每个循环递减0.5℃40 s，72℃90 s）；72℃2 min后4℃60 min，在10μL PCR产物加入5单位虾碱性磷酸酶及2单位核酸外切酶Ⅰ，37℃温浴1 h，75℃灭活15 min。连接程序为38个循环（94℃1 min，56℃4 min），4℃60 min取0.5 μL稀释后连接产物，同0.5μL Liz500 SIZE STAN‐DARD与9μL Hi-Di混匀后95℃变性5 min，采用ABI3730XL测序仪开展监测，利用GENEMapper 5.0生物系统分析并将最终结果输出。

1.3统计学方法采用SPSS 22.0软件，计量资料采用±s的形式表示。两独立样本t检验分析组间差异；采用Hardy-Weinberg平衡规律检验样本代表性；计数资料采用频数或百分比的形式表示，χ2检验分析组间差异。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1CYP7A1基因rs4738687多态性CYP7A1基因rs4738687位点检测出AA、GA和GG基因型，观察组和对照组rs4738687位点多态性符合Hardy-Weinberg平衡规律。

2.2两组rs4738687多态性比较观察组和对照组rs4738687位点基因型和等位基因分布比较均差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 观察组（乙型肝炎病毒感染病人）和对照组（健康体检者）rs4738687多态性比较

2.3观察组不同疾病病人rs4738687基因型及吸烟、饮酒情况比较观察组HBV相关肝硬化病人rs4738687位点AG+GG基因型比例明显高于慢性HBV感染病人（P<0.05）；慢性HBV感染和HBV相关肝硬化病人吸烟、饮酒比较均差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3 观察组［乙型肝炎病毒（HBV）感染病人］不同疾病病人rs4738687基因型及吸烟、饮酒情况比较/例（%）

2.4观察组不同性别、年龄病人rs4738687基因型比较观察组不同性别、年龄病人rs4738687位点AG+GG基因型比例比较均差异无统计学意义（P>0.05），见表4。

表4 观察组（乙型肝炎病毒感染病人）不同性别、年龄病人rs4738687基因型比较/例（%）

3 讨论

乙型病毒性肝炎是临床常见的肝脏传染性疾病，我国流行病学调查显示在1～4岁、5～14岁、15～29岁人群中HBV表面抗原流行率为0.32%、0.94%、4.38%，每年有近百万人死亡于肝硬化、原发性肝癌等严重肝脏疾病，严重地影响了人们身心健康和生命质量［3-4］。HBV感染病人随着病情不断进展会逐渐发展为肝硬化，肝细胞广泛变性、坏死，再生结节形成，结缔组织增生，导致肝脏中的血液循环障碍，肝细胞营养障碍加重，门静脉高压、肝功能损害［5］。病理学研究发现HBV感染病人出现细胞外基质的异常沉积，肝星状细胞发挥了主要的调节作用，一旦病人肝脏细胞受到损伤后，肝星状细胞会大量增殖，促进了胶原合成，朝向成纤维细胞转化，大量增生的纤维组织会重新分割包绕肝细胞，让正常的肝小叶结构转变成为肝硬化结节，因此慢性肝炎肝硬化均是肝细胞纤维化程度加重累积过程［6-7］。此外内质网应激诱导炎症、凋亡和上皮细胞间质转变属于刺激因素参与到组织损伤和HBV感染发生发展过程中，目前临床寻找诊断HBV感染特异性和敏感性的非创伤性指标极为重要，已有的血清学指标在评估肝纤维化程度时可能受到肝脏炎症活动度影响［8-9］。

HBV感染病人病毒持续存在的原因尚不清晰，有报道指出即使同种族、性别及年龄相似的个体经同一种方式感染相同的病毒亚型，也会产生不同的后果，这提示了遗传基因因素在慢性乙型肝炎中起着重要的作用［10-11］。本研究中重点分析了CYP7A1基因rs4738687多态性与HBV感染之间的关联，CYP7A1是细胞色素P450酶，主要特异性存在人体肝脏微粒体，包含6个外显子与5个内含子，也是人体催化胆固醇朝向胆汁酸转化的第1步，属于胆汁酸合成限速酶，胆固醇可以转变为7α-羟胆固醇，胆固醇核还原、羟化等过程形成具有24碳初级胆汁酸与结合胆汁酸，可以反映人体胆汁酸合成的快慢［12-14］。研究显示当人体出现胆汁淤积会导致胆汁酸代谢紊乱，造成肝细胞损伤与凋亡，严重的会发生坏死，而在HBV感染病人肝细胞中的CYP7A1会表达升高12倍，且同肝脏组织损伤严重程度呈现正相关性［15-17］。还有学者发现宿主因素特别是宿主基因单核苷酸多态性是导致HBV感染与疾病进展的重要因素，单核苷酸多态性可能会影响CYP7A1表达引发胆汁酸生成，造成肝脏不同程度炎症反应［18-19］。本研究分析的rs4738687位点主要在该基因内含子，内含子突变会导致基因发生剪接，对基因表达发挥调控作用，有报道指出该位点的突变与近端大肠癌发病关系密切［20］。本研究观察发现肝硬化病人AG+GG基因型比例显著升高，提示该位点出现突变后可能会导致HBV感染病人疾病出现进展，而在性别与年龄分层发现，观察组不同性别、年龄病人rs4738687位点AG+GG基因型比例比较差异无统计学意义，说明HBV感染病人CYP7A1基因rs4738687位点基因型与等位基因在性别与年龄分层方面不具有差别，但是由于本研究纳入病人数量较少，尤其是女性病人的样本含量还不够大，可能导致各基因型分布比例偏差较大，需要扩充样本量进一步验证上述位点的意义。

本研究分析显示CYP7A1基因rs4738687位点检测出AA、GA和GG基因型，观察组和对照组rs4738687位点多态性符合Hardy-Weinberg平衡规律，而且观察组和对照组rs4738687位点基因型和等位基因分布比较差异无统计学意义，说明HBV感染病人CYP7A1基因rs4738687位点基因型与等位基因方面同健康人群差异无统计学意义。观察组HBV肝硬化病人rs4738687位点AG+GG基因型比例明显高于慢性HBV感染病人，说明肝硬化病人CYP7A1基因rs4738687位点AG+GG基因型比例显著升高，也提示了上述位点发生突变后可能加速病人肝脏功能恶化，使HBV慢性感染发展为肝硬化。本研究的优势在于提出了CYP7A1基因rs4738687多态性在HBV感染病人中的变化，为临床研究国人HBV感染不同临床结局遗传基础的认识，但是仍需开展多中心、多民族、大样本、多基因的联合分析，并进行相关功能学及感染机制的研究，为HBV感染的防控提供依据。

综上述所，CYP7A1基因rs473868位点多态性与HBV感染易感性无明显关系，但可能与HBV肝硬化发生存在正相关关系。