外源脯氨酸对缓解红砂干旱胁迫的机理研究

苏世平，李毅，刘小娥，种培芳，单立山，后有丽

（甘肃农业大学林学院，甘肃 兰州 730070）

在植物的生活史中，经常会遭遇干旱、低温等逆境胁迫［1］。胁迫会对植物体形态、物质代谢和逆境基因表达等造成影响，进而影响植物正常的生长发育，严重时会导致植物死亡［2−3］。干旱胁迫是一种典型的非生物胁迫，广泛存在于干旱半干旱地区［4−5］。植物在受到干旱胁迫时会产生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），出现细胞渗透势下降、光合色素降低［4−6］、光合作用减弱［7］，造成植物代谢紊乱，生长受限，严重干旱时，将会使植物生长停滞，甚至发生死亡［3，8−9］。干旱荒漠区由于水分亏缺，较高的环境温度通常会造成植物蒸腾加速，失水萎蔫，造成植物生长衰退，导致干旱半干旱荒漠区植被退化［10］。因此通过人工措施降低干旱胁迫对荒漠区植物的伤害，促进其更好地生长。国内外学者在灌溉、施肥、施用外源物质以保证植物体正常生长发育等方面进行了大量研究。有研究表明，水杨酸处理干旱胁迫中的小麦（Triticum aestivum）植株，能显著提高其抗氧化酶系统的活性和渗透调节物质的积累，能有效降低膜脂过氧化［11］；硫酸钾处理能显著提高干旱胁迫下玉米（Zea mays）的生长属性、叶片相对含水量（relative water content，RWC）、叶绿素总量和脯 氨酸（proline，Pro）等指标［12］；在油菜（Brassica napus）叶面喷施海藻提取物能显著提高其光合色素含量、自由基清除能力和超氧化物歧化酶活性以及叶片脯氨酸含量（P＜0.05）［13］；对小麦植株施用外源NO 能有效调节植物−水关系、提高抗氧化防御系统活性、提高渗透调节物质积累、降低膜脂过氧化，减缓干旱胁迫对小麦植株的伤害［14］。外源脯氨酸处理滨柃（Eurya emarginata）植株发现，Pro 能显著影响植株的抗氧化酶系统活性和代谢调节系统，从而有效缓解干旱对植株的伤害［15］。因此，采用外源物质能显著影响植物的抗氧化系统、代谢调节系统以及光合系统，提高植物对干旱环境的适应能力。

脯氨酸是一种小分子有机物，水溶性大，是最有效的渗透调节物质之一，被称作植物体的防脱水良剂［16］。Pro能维持植物细胞膜结构和蛋白质等亚细胞结构的稳定性以及具有清除活性氧的作用［16−17］。有研究表明，干旱胁迫等逆境条件下，由于生物降解的抑制和Pro 合成酶的活化致使植物体内游离Pro 大量积累［18］。前人［16，19−20］研究发现，外源Pro 能显著提高干旱胁迫下烤烟（Nicotiana tobacum）幼苗抗氧化酶活性以及叶片渗透调节物质的含量，减缓干旱胁迫导致的氧化和伤害，进而提高其抗旱能力，延缓植株衰老进程。苏贝贝等［21］研究发现3 和5 mmol·L−1的Pro 能显著提高高温胁迫下半夏（Inellia ternata）的抗氧化酶活性，缓解细胞的氧化和伤害，而超过此浓度时，Pro 反而减弱或抑制了缓解作用。Ali 等［22］研究表明，在盐胁迫植物上施用脯氨酸缓解了盐胁迫对光系统Ⅱ（photosystem Ⅱ，PSII）功能的伤害，有助于提高PSII 的活性和电子传递量子产率，能显著提高植株的光合速率。因此，施用适宜浓度的外源Pro 能通过调控逆境胁迫下植物体的抗氧化酶活性、代谢调节物质含量以及光合系统的活性，进而提高植物抗逆性或缓解干旱胁迫造成的伤害。

红砂（Reaumuria soongorica）为超旱生小灌木，具有很强的抗旱能力，广泛分布于中国西北干旱半干旱荒漠区，是典型的荒漠灌木［23−25］，对维护荒漠区生态安全具有重要的意义。目前，对红砂抗旱性的研究较多［23−25］，但关于干旱胁迫下红砂对外源Pro 作用的响应机理研究报道比较少。因此，本研究通过对处在干旱胁迫下的红砂植株叶片喷施不同浓度Pro，探讨叶片渗透调节物质、抗氧化酶、光合色素、光合特性以及生长特性的响应规律，以揭示外源Pro 在提高红砂抗旱能力方面的作用机理，为荒漠区红砂种群的保护提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于甘肃省武威市林业技术服务中心的超旱生植物良种基地（38°24′N，103°9′E），地处腾格里沙漠边缘，干旱少雨，蒸发量大，属典型的温带大陆性荒漠气候，海拔1378 m，年均气温6.9 ℃，年均降水量为113.2 mm，多集中在8−9月，年均蒸发量为2604.3 mm［26］，土壤类型为砂质壤土，pH 值为7.2，地下水位为100 m。

1.2 试验设计

1.2.1 干旱处理 在试验地选择环境相对均一的3 个10 m×10 m 的样地作为研究小区，于2017年4月−2018年8月进行控水处理，不进行灌溉，水分来源依靠自然降水，控水期间用EM50（美国）测定土壤30 cm 处含水量。

1.2.2 外源脯氨酸处理 2017年7月13日，2018年7月10日，土壤含水量最低，为2.5%，进行外源Pro 处理，Pro 设置5 个浓度处理（P1：50 mg·L−1、P2：100 mg·L−1、P3：150 mg·L−1、P4：200 mg·L−1、P5：250 mg·L−1），每个处理6 株，共30 株，3 个小区共90 株，在无风晴朗的早晨，待露水散尽后，用手持式喷雾器将不同浓度的Pro 均匀喷施在红砂树冠的叶面上，以树冠叶面挂满水珠下滴为止。

1.2.3 叶片采样 在处理当天（第0 天，D0作为对照，CK），处理后第1，3，6 和9 天（分别表示为D1、D3、D6和D9），早晨露水散尽后用LI−6400 光合仪（美国）测定叶片光合特性，之后采集叶片，并立即放入液氮罐中带回实验室进行各项指标的测定。叶片采集时，在各处理的6 株红砂上，每株采集等质量叶片后混合作为该小区该处理样品。如果在处理期间遇降水，用塑料棚遮挡小区，防止降水进入小区。

1.3 测定指标与方法

采用蒽酮比色法测定可溶性糖（soluble sugar，SS）含量；采用磺基水杨酸提取法测定游离脯氨酸（free proline，Pro）含量；采用考马斯亮蓝染色法测定可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量；采用氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用愈创木酚法测定过氧化物酶（peroxidase，POD）活性；采用紫外吸收法测定过氧化氢酶（catalase，CAT）活性，采用分光光度法测定叶绿素含量（chlorophyll，Chl）。以上测定方法参考李合生［27］、高俊凤［28］。

使用LI-6400 便携式光合仪测定光合参数，设定光量子通量密度为1500 μmol·m−2·s−1，温度为35 ℃，CO2浓度为380 μmol·mol−1，湿度为大气湿度，对90 个处理植株每株选取南面树冠中部的叶片，于晴天上午9：00 开始，测定叶片的净光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、气孔导度（stomatal conductance，Gs）、胞间二氧化碳浓度（intercellular carbon dioxide concentration，Ci）和蒸腾速率（transpiration rate，Tr），每株重复测定2 次，取平均值。

生长指标测定：对各处理单株东南西北处各选择一个侧枝进行标记，在处理后的第9 天测定株高生长量（cm）、侧枝生长量（cm）、地径生长量（mm），统计侧芽萌发数（个）。

1.4 数据处理与分析

统计分析提供的数据来自两年的野外试验，使用SPSS 17.0 软件进行方差分析，采用Duncan 检验各组间差异。

2 结果与分析

2.1 脯氨酸处理对红砂植株生长的影响

红砂植株经过Pro 处理后，对各生长指标在处理年份间、处理浓度之间（除侧芽萌发数）均有极显著影响（P＜0.01）（表1）。各生长指标表现出在2017年显著低于2018年（P＜0.05）。

表1 外源脯氨酸处理对红砂植株生长性状的影响Table 1 Effects of exogenous Pro treatment on growth traits of R.soongorica

红砂植株的株高净生长量、地径净生长量、侧芽萌发数以及侧芽净生长量随Pro 浓度的增加呈先增后降的趋势，但侧芽萌发数在各处理间差异不显著（P＞0.05）。各生长指标以P2处理表现最佳，株高净生长量为2.48 cm，侧芽萌发数为3.67 个，侧芽净生长量为1.87 cm，地径净生长量为0.27 mm。可见，100 mg·L−1Pro 处理能明显提高红砂植株的生长。

2.2 脯氨酸对红砂叶片代谢调节产物和抗氧化酶系统的影响

红砂植株经脯氨酸处理后，叶片代谢调节系统（SS、SP、Pro）和抗氧化酶系统（CAT、SOD、POD）在处理年份间、脯氨酸处理浓度间（除可溶性糖）、处理作用时间（除游离脯氨酸）以及脯氨酸浓度与处理作用时间交互作用均有显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）差异（表2）。各项指标在2017年低于2018年；除SS 外，各指标在Pro 处理后，随处理后作用时间的延长呈现先增加后降低的趋势；SS、SP、Pro 在Pro 处理浓度间没有明显的变化规律，SOD、CAT 和POD 活性随浓度增加呈现先升高后降低的趋势。

表2 Pro 处理对抗氧化酶系统和渗透调节系统的影响Table 2 Effects of exogenous Pro on antioxidant enzyme system and osmotic regulation system of R.soongorica

100～250 mg·L−1的Pro 处理红砂植株，在处理早期能有效提高红砂叶片中SS、SP、Pro 的含量。其中100 mg·L−1Pro 处理提升最高，处理后第9 天与第0 天相比，SP 含量增加了4.48%，Pro 增加了131.07%，SS 降低了6.42%，除Pro 外，均与处理前第0 天之间差异不显著（P＞0.05）。可见，喷施100 mg·L−1的脯氨酸能有效提高红砂叶片SS、SP、Pro 的积累量，提高细胞的渗透压，增强细胞持水能力，在一定程度上缓解干旱胁迫造成的伤害。

50～200 mg·L−1的Pro 处理红砂植株，能显著提高处理早期SOD、POD、CAT 活性。其中以100 mg·L−1Pro处理效果最佳，处理后第9 天与第0 天相比，SOD 活性降低1.95%，CAT 活性提高30.66%（P＜0.05），POD 活性提高12.30%，可见，喷施100 mg·L−1的脯氨酸能有效提高红砂植株由于干旱胁迫而产生的过氧化氢、超氧阴离子自由基以及酚类等有害物质的清除能力。

2.3 脯氨酸处理对红砂叶片光合色素的影响

植物在逆境环境下可通过降低叶绿素含量来减弱由于光合作用和蒸腾作用而造成的水分亏缺，叶绿素含量减少的程度与受逆境胁迫的程度和植物对逆境的抵御能力有关。本研究发现，红砂植株经脯氨酸处理后，对叶片光合色素含量在处理年份间（除叶绿素a/b，chlorophyll a/b，Chl a/b）、脯氨酸处理浓度间、处理后的作用时间、脯氨酸浓度与处理后作用时间交互作用均有极显著影响（表3）。各指标在年际间表现出2017年低于2018年；各指标在Pro 处理后，随处理后作用时间的延长，总叶绿素［total chlorophyll，Chl（a+b）］、叶绿素a（chlorophyll a，Chla）、叶绿素b（chlorophyll b，Chlb）含量总体呈降低趋势，Chl a/b 呈升高趋势。Chl（a+b）、Chla 和Chlb 随Pro浓度升高呈先升后降趋势，Chl a/b 呈先降后升趋势。

表3 Pro 处理对红砂光合色素的影响Table 3 Effects of exogenous Pro on photosynthetic pigments of R.soongorica

光合色素含量［Chl（a+b）、Chla、Chlb］在P4、P5浓度处理下呈现降低趋势，P2、P3浓度处理下呈先升高后降低趋势，同一Pro 浓度处理下，随着处理时间的延长，处理后第9 天与第0 天相比，P2处理降幅最小，其中Chl（a+b）、Chla、Chlb 分别降低5.81%、1.47%和22.22%。P1、P4、P5处理后，Chl a/b 呈现升高趋势，升高幅度可达66.05%（P5处理的第9 天），而P2、P3在处理初期呈现缓慢降低趋势，在第6 天开始升高。可见，喷施100 mg·L−1Pro 能显著降低由于干旱胁迫而引起的光合色素降解，提高光能利用效率，对干旱胁迫中红砂的受胁迫程度有一定的缓解。

2.4 脯氨酸处理对红砂叶片光合特性的影响

红砂植株经过Pro 处理后，净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）、胞间CO2浓度（Ci）以及水分利用效率（WUE）在处理年份间、脯氨酸处理浓度间、处理作用时间之间及脯氨酸浓度与作用时间相互作用间均有显著或极显著差异（表4）。各指标在年际间表现出2017年显著低于2018年（P＜0.05），各指标在Pro 处理后，随处理后作用时间的延长总体呈现降低趋势，随Pro 浓度升高呈先升后降趋势，且差异显著（P＜0.05）。

表4 Pro 处理对红砂光合特性的影响Table 4 Effects of exogenous Pro on photosynthetic characteristics of R.soongorica

在5 个浓度处理中，均表现出随着处理后作用时间的延长，Pro 作用效果显著降低。P2、P3处理在早期提高了Pn、GS、Tr、Ci以及WUE，在处理后第9 天均低于处理前第0 天，其中以P2处理最佳，与处理前第0 天相比，第9 天Pn、GS、Tr、Ci以及WUE 分别降低了16.07%、10.00%、6.44%、7.68%和9.92%，在5 个处理中，P2降幅最小。说明干旱胁迫下红砂植株经100 mg·L−1Pro 处理后能有效减缓光合能力的降低。

3 讨论

水分亏缺是荒漠区植物最容易遭受的非生物胁迫，严重时会减缓植物的正常生命活动，甚至会导致植物死亡［8］，因此人们通常采用灌溉、喷施外源物质等措施来降低植物因水分亏缺造成的伤害。本研究发现，通过对处在干旱胁迫下的红砂植株喷施一定浓度的外源Pro 能有效提高红砂叶片抗氧化酶系统的活性、代谢调节产物的含量、光合色素含量、光合特性以及植株生长量，对干旱胁迫有一定的缓解作用。

在本研究中所测定的指标，除叶绿素a/b 外，其他指标均在研究的两个年份之间差异显著，这可能是不同年份之间气候差异所致。尽管对研究期间土壤含水量进行了控制，但是在不同年份试验期太阳辐射、大气湿度、风等生态因子可能存在差异，因此导致不同试验年份间差异显著，这与Taia 等［29］和Semida 等［30］在不同季节和不同年份对西葫芦（Cucurbita pepo）和洋葱（Allium cepa）的研究结果一致。

植物在干旱环境中，由于根系吸收不到生长需要的水分，造成干旱胁迫。干旱胁迫诱导植物大量合成Pro、SS、SP 等渗透调节物质，其含量与抗旱能力呈正相关。本研究发现，施用100 mg·L−1Pro 能显著提高红砂叶片的Pro、SS、SP 含量，这可能是外源Pro 喷施补充了内源Pro 的累积量，更多的Pro 参与了蛋白质的合成［17，31］，Pro 和SP 含量的提升，能有效调节细胞与外界的渗透压，保护细胞膜与蛋白质活性，维持细胞的生理生化功能得以正常进行。本研究结果与王玮等［32］、梁太波等［19］对逆境胁迫中的萝卜（Raphanus sativus）、烤烟采用外源Pro 处理的研究结果一致。

在正常情况下，植物体内的活性氧处于动态平衡，不会对植物细胞产生伤害，但当植物遭受逆境胁迫时，这种平衡就会被打破，导致活性氧的过量积累，引起膜脂过氧化，使植物代谢紊乱。本研究发现，对处于干旱胁迫中的红砂采用100 mg·L−1Pro 处理，能显著提高SOD、POD、CAT 活性，缓解活性氧对植株的伤害，这可能是在干旱胁迫下，红砂细胞的活性氧积累和膜脂过氧化加剧，植物需要合成更多的保护酶来清除该类物质。另一方面，由于外源Pro 的施用有效地提高了红砂体内Pro 的积累量，而Pro 可激活SOD、CAT 等抗氧化酶的活性，进而提高对活性氧的清除能力。这与苏贝贝等［21］、马文广等［20］对逆境胁迫下半夏、烟草采用Pro 处理的研究结果一致。本研究也发现，外源Pro 浓度过高反而会加剧干旱胁迫的伤害，可能是高浓度的外源Pro 处理后会产生过量的代谢产物吡咯琳-5-羧酸（P5C），而P5C 会增加ROS 的产生，加剧了红砂的过氧化伤害，这与沙汉景等［33］对盐胁迫下水稻（Oryza sativa）采用外源Pro 处理的研究结果一致。

干旱胁迫下，植物体内渗透调节物质通过调节细胞渗透势而维持细胞吸水能力，抗氧化酶系统通过清除ROS 来保护膜系统，进而缓解干旱胁迫对植株的伤害，但二者之间并不是独立作用，而是相互协同、相互影响。据沙汉景［17］报道，植物体内的Pro 也能清除细胞内的ROS。施用外源Pro 后红砂植株体内的游离Pro 含量升高，也可能提高了Pro 对ROS 的清除能力。

叶绿素是光合作用的一类重要色素，其含量对植物的光合作用有重要的影响。当植物受到逆境胁迫时，叶绿体中活性氧的大量积累，导致叶绿素降解，总叶绿素含量下降，从而影响植物对光能的正常吸收，影响后续光能的传递、耗散和分配，直接导致叶绿素荧光参数的变化，破坏光合作用的正常进行［34］，最终导致植物光合速率的降低［35］。本研究发现，红砂植株在施用100～150 mg·L−1的Pro 后，能有效抑制叶绿素的降解进程，同时叶绿素b 含量的升高是导致总叶绿素含量升高的主要原因，叶绿素b 主要吸收短波光，因此，叶绿素b 含量的升高提高了红砂对蓝紫光等短波光的利用效率，最终导致红砂净光合速率的提高。本研究也发现，采用100～150 mg·L−1的外源Pro 处理红砂植株后，总叶绿素、叶绿素a 和叶绿素b 含量变化幅度较小，在处理初期，呈现缓慢上升趋势，后期降低，与其他指标相比，升幅和降幅都比较小，表现出一定的滞后性，这可能与叶绿素的合成过程有关。叶绿素的合成是一个复杂的过程，需要15 个过程，15 种酶参与，受到光照、温度、Mg、Fe、Cu、Mn、O 等元素的影响［36］。因此，叶绿素的合成需要经历一定的时间，这也就很好地解释了本研究中光合色素变化幅度小的现象。

光合作用是植物生长所需物质和能量的来源，在物质转化和能量代谢中发挥重要作用，干旱胁迫可导致植物净光合速率降低，生长受限。一般认为，逆境条件下，植物的光合速率受气孔因素和非气孔因素影响，如果植物在逆境条件下，胞间二氧化碳浓度（Ci）和气孔导度（GS）同时下降，则说明光合速率的下降是受气孔因素影响的，反之，如果气孔导度下降，而胞间二氧化碳浓度（Ci）维持不变或升高，则说明是非气孔因素决定的［37］。本研究中，外源脯氨酸处理红砂植株后，GS和Ci在相同浓度处理下，具有相同的变化趋势，说明干旱胁迫下，气孔因素是引起红砂光合速率下降的因素。本研究也发现，100～150 mg·L−1Pro 在处理早期能显著提高红砂幼苗的气孔导度、胞间二氧化碳浓度、水分利用效率、蒸腾速率，提高了植株的净光合速率，这可能是100～150 mg·L−1的Pro 能促使已关闭的气孔再次开放，缓解了干旱对光合作用的影响，这与杨丙贤等［38］、苏贝贝等［21］、颜志明等［39］的研究结果相似。而高浓度的Pro 处理反而起到抑制效果，可能是高浓度的Pro 会使植物产生过量的P5C，而P5C 会增加ROS的产生，当大量的ROS 在叶绿体中积累时，势必导致叶绿素降解，因此造成光合速率的降低。

逆境胁迫下，植物通过调控各种生理生化过程以提高其对逆境的抵御能力，这种抵御能力的提高最终表现在植物的生长特性上，因此，植物在逆境条件下的生长量可以用来判断其对逆境的抵御能力。本研究发现，100 mg·L−1Pro 处理能有效促进红砂植株的生长量，这可能是适宜浓度的外源Pro 处理红砂后，通过调控红砂植株的生理生化特性，显著提高了红砂的光能和水分利用效率，进而提高了红砂的生长。这与Taia 等［29］的研究结果一致。

4 结论

外源Pro 处理处于干旱胁迫下的红砂植株，对渗透调节物质的含量和抗氧化酶系统的活性、光合色素、光合系统以及植株生长均影响显著，其中以100 mg·L−1的Pro 处理最佳，可显著提高叶片SS、Pro 和SP 含量，提高SOD、POD 以及CAT 活性，能促使叶绿素的合成，进而提高净光合速率和水分利用效率，缓解干旱胁迫对红砂的伤害，促进其生长。