发光核酸适配体的筛选及应用

周子琦 张洋子 兰欣悦 刘洋儿 朱龙佼 许文涛

（1. 中国农业大学食品科学与营养工程学院 食品质量与安全北京实验室，北京 100083；2. 中国农业大学营养与健康系 食品精准营养与质量控制教育部重点实验室，北京 100083）

先进的活细胞生物分析手段有助于我们更好地了解生命活动的运作模式、实现细胞内目标物质的原位检测和成像，对研究细胞代谢有重要意义，同时有助于临床医学的发展［1-2］。随着相关研究的深入，一系列胞内成像技术得到开发，但技术存在的局限性不容忽视［3-5］，例如分子信标法中的反义序列会对活细胞造成致命伤害［6-7］，而常用的蛋白标记方法，如MS2-绿色荧光蛋白融合蛋白（MS2- GFP）系统，则会造成细胞蛋白表达超负荷，且难以直接对目的基因实现精准定位［8］。

核酸发光适配体（LNAs）的研发为活细胞内物质原位分析所面临的挑战提供了一种适合而新颖的应对策略，现如今越来越多的LNAs得到开发和优化。LNAs是一类能够特异性地结合荧光团等小分子物质、诱导和增强其发光的FNAs［7］。与分子信标、荧光蛋白标签和多拷贝融合蛋白系统相比，LNAs提供了一种快速准确的基因定位方法［9］，甚至一些单拷贝的LNAs在结合荧光团后就能在活细胞中发出清晰明亮的荧光［10］，最强的LNA可以将荧光团等小分子的荧光强度提高3 000倍［11］。在输出器件的帮助下，它们可以作为细胞内外的优秀生物传感器，进一步应用于生物分析。本文综述了LNAs的筛选过程，总结了LNAs系统在生物传感方面的应用，分析了当前LNAs研究的不足之处，以期能够拓宽生物传感研究领域，使LNAs系统成为细胞内外物质成像与检测的优秀传感元件。

1 LNAs的获得

实际上，LNAs就是荧光团等小分子的适配体［12］，因此可以通过配体指数富集的系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）获得［13-14］。DNA发光适配体（DNA light-up aptamers，DLAs）和RNA发光适配体（RNA light-up aptamers，RLAs）的SELEX条件略有不同 （图1），应用场景与最适检测物质也各有偏重，因此对于不同种类的LNAs来说，最适合的就是最佳的筛选方法。

图1 采用SELEX等技术对LNAs进行体外筛选Fig. 1 In vitro selection of LNAs using SELEX and other techniques

1.1 DNA发光适配体的体外筛选

DLAs主要通过基于靶分子与其LNAs之间亲和力的亲和层析-SELEX获得［14］，一般方法有珠基- SELEX、目标结合触发释放-SELEX和氧化石墨 烯（graphene oxide，GO）-SELEX［12，15］。前 两种方法之间最显著的区别是固相载体上的对象。珠基-SELEX的工作原理是将靶分子修饰到琼脂糖珠或磁珠上［16-17］，然后与DNA文库孵育。例如Sando等［18］利用Hoechst衍生物7，通过生物素-链霉亲和素（streptavidin-biotin）磁珠-SELEX获得了Hoechst的第一个DLAs：I-1-mini。而在目标结合触发释放-SELEX的过程中，DNA文库与修饰在珠基上的互补序列结合，当序列与靶分子结合时就会被释放到溶液中，用这种方法，研究者得到了孔雀石 绿（malachite green，MG）［19］、结 晶 紫（crystal violet，CV）［16］、硫黄素T（thioflavine T，ThT）［15］以及小檗碱（berberine，BBR）［20］的LNAs。与前两种方法相比，GO-SELEX省去了复杂的修饰。由于GO可以吸附无结构的单链核酸，文库就可以与GO结合，在上清液中去除结构化和未结合的序列后，将氧化石墨烯与目标分子混合，使结构化的序列留在上清液中。Islam等［15，21］就用此法筛选得到了ThT的LNA——ThT.2-2。

1.2 RNA发光适配体的体外筛选

与DLAs相比，RLAs可以依靠转录在活细胞内大量产出，因此更适合RNA等物质的胞内检测。在筛选时，不仅需要增加转录环节，还需要考虑应用环境。细胞内具有多种酶和离子的复杂环境使得体外筛选获得的高度特异性RLAs可能无法正常发挥作用，此外其他RNA的竞争性结合还会导致RLAs的错误折叠，所以亲和力不能作为NALAs的唯一选择依据，亲和层析-SELEX也不是NALAs的最佳选择方法［11，22-26］。一些新的或联用的方法可以很好地解决上述问题，荧光激活细胞分选-SELEX（fluorescence activated cell sorting -SELEX，FACSSELEX）是将RNA文库作为表达载体转化进大肠杆菌中并诱导大规模转录的半活体筛选方法，在培养液中加入靶分子就可以观察细菌的发光情况（图1），FACS-SELEX可以将RLAs诱导靶分子的光学特性作为筛选条件，同时确保它们在细胞中仍能够执行正常的功能，苯胺取代的磺酰罗丹明（aniline-substituted sulforhodamine，ASR）和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）荧光团衍生物DFHBI-1T的LNAs就是通过此方法获得的［27-28］。微流体辅助的体外分选-SELEX（microfluidic-assisted in vitro compartmentalization -SELEX，μIVC-SELEX）也是一 种新型RLAs筛选方法，该方法与前两种方法不同的是，它以小液滴为筛选单位，并可以准确地测定每一个单位中LNAs的亲和及发光性能，通过控制外部电压以及微流控面板上的不同管道来引导液滴流动，进而完成分选［10，29］。Ryckelynck等利用该方法对GFP荧光团衍生物的LNAs——Spinach和Broccoli进行了优化，并筛选出了磺酰罗丹明B二聚体 Gemini-561的LNA［10，29-30］。

1.3 LNAs的最佳筛选方法

在一定程度上，检测需求决定了LNAs筛选方法。目前基于LNAs开发的生物传感器主要用于细胞内外特定核酸序列、代谢物和小分子毒素的检测［16，20-21，24，31］。DLAs的应用场景显然比RLAs更广阔，可以自如地成为体外检测设备的基本元件。虽然DNA相比于RNA结构更稳定一些，但是在体外复杂环境中单链DNA的结构也不够稳定，波动的构象会导致靶向效率降低，所以基于目标结合触发释放-SELEX的筛选方法更适合DLAs。这是因为该方法保证了单链DNA的稳定性，增加了特异性结合的选择压力，这种方法与珠基-SELEX相比，可以避免因为染料分子中活性位点较少而结合不强的情况，使DNA库可以完全与染料分子接触［12］。

同时，基于RLAs的生物传感器更倾向用于细胞内物质（RNA和蛋白质）的成像［2，7，11，23，32-34］。筛选手段的选择需要综合考虑RLAs的结合特异性、结构和发光稳定性以及细胞毒性。因此，在筛选RLAs时不应局限于一种选择方法，如FACS-SELEX或μIVC- SELEX。串联SELEX（这里指的是将几种筛选方法串联使用）可以通过增加选择压力，尽可能模拟细胞环境，获得效能更强的RLAs［27，30］。

2 LNAs系统在生物传感领域的应用

2.1 胞内生物成像应用

LNAs系统的研发和使用均始于细胞。1999年，世界上第一条LNAs诞生在一次生色团辅助激光灭活（chromophore-assisted laser inactivation，CALI）实验中，为了得到细胞内有功能的目的基因，人们获得了一条MG的适配体，没想到它可以增强MG的荧光接近2 360倍；到后来，科学家参透了GFP的结构发现，长肽链构成的富氧刚性环境竟为内部荧光团分子的脱氢、发光提供了天然的条件，对于GFP的模仿就开始了，越来越多的LNAs被研发出来，要多适合作为LNAs的荧光团或小分子物质也得到开发与合成，并逐渐取代蛋白标签、分子信标等手段，广泛应用于胞内成像领域［10，13，29，35-41］。在长达20年的更新换代中，无论是在意外获得的MGA，还是取代GFP的菠菜（GFP荧光团DFHBI的LNA，Spinach）［23，42］，它们都提高了细胞内物质成像的准确性和灵敏度。目前，LNAs系统可以在活细胞内对蛋白质和RNA实现原位成像，还可以用于跟踪部分小分子代谢物。

LNAs可以作为一种稳定的RNA标签，插入目标RNA的侧翼序列实现协同转录，在加入相应的靶分子后，实现对胞内RNA的实时成像［4，6，9］。目前，LNAs系统可以用于追踪毒性RNA，外来病毒RNA中的rRNA、mRNA，三重核酸重复序列等等序列（图2-A）［34，36，39］，Strack等［34］将Spinach与毒性RNA序列中常见的三核酸重复序列（CGG）60（在此之前该三核酸重复序列并未深入研究过，该三核酸重复序列的转录物可以通过积聚在细胞核中造成功能蛋白质的分离，产生细胞毒性，进而造成细胞损伤）连接在一起瞬时转染COS-7细胞，该方法成功检测到了（CGG）60序列形成的RNA颗粒，并观测到随着细胞分裂该RNA颗粒从分散到聚集的动态变化（图2-A），为三核酸小分子药物的研发提供了非常生动直观的研究基础；在这之后，Nilaratanakul等［36］将引发脊髓炎的神经元病毒Sindbi病毒的基因组（可产生病毒结构性蛋白）、亚基因组（可产生病毒非结构性蛋白）与搭载了两个F30支架的两个西兰花（GFP荧光团衍生物DFHBI-1T的LNA，Broccoli）结合，并将带有结合序列的表达盒插入SINV的cDNA克隆中，获得具有4-28个Broccoli拷贝的病毒重组基因组，该病毒重组基因组成功帮助研究人员观察到了病毒RNA侵染神经细胞的过程和偏好性。除了研究目标序列的动态追踪和定位，LNAs甚至可以作为一簇规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）元件，完成基因座成像，实现RNA谱系分析和超分辨率成像。值得一提的是，对完整的LNAs序列进行劈裂处理，并将劈裂后的序列连在不同RNA序列上，还可以实现对RNA互作的研究（图2-D）［43］。

LNAs系统也适用于活细胞内的蛋白成像。可将LNAs与物质特异性适配体或结合序列连接在一起，在细胞内共转录，就可以在胞内结合特定物质，在染料分子的存在下可实现细胞内的成像。Jaffrey团队利用这种方法通过Spinach在体外实现了链霉亲和素、凝血酶和大肠杆菌MS2衣壳蛋白（MCP）的成和定量检测，之后该团队使用MCP -Spinach来成像活细胞中的蛋白质，并完成了对单个细胞内源性蛋白表达变异性的检测［44］。紧接着在2016年，该团队使用甲基化修饰的无光版Broccoli开发了一种高通量检测RNA修饰酶的方法，无光的Broccoli通过结合去甲基化脂肪和肥胖相关蛋白（FTO）或m6A去甲基酶ALKBH5后去甲基化而重新发光，这种方法还可以用来选择FTO抑制剂（图2-B）［45］。

此外，LNAs系统还可以用于检测细胞中的小分子代谢物，如5'-二磷酸腺苷（adenosine 5'-diphosphate，ADP），腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-methionine，SAM）［46-47］，环二鸟苷酸（cyclic di-GMP），环腺苷酸-鸟苷酸（cyclic AMP-GMP）［48］和硫胺素焦磷酸（thiamine 5'-pyrophosphate，TPP）［49］，可以将小分子代谢物的适配体与LNAs结合，通过适配体结合小分子后发生的构象变化，使LNAs形成诱导发光的正确构象实现结合发光。Paige等［46］就是将代谢物适配体与Spinach结合，并通过打开Spinach的DFHBI结合环将两者连接（图2-C），该适配体复合物可动态监测活细胞中的ADP和SAM。

图2 LNAs系统在活细胞内的应用Fig. 2 Application of LNAs system in living cells

2.2 体外生物传感应用

体外检测环境简单可控，背景值比胞内检测低，这些条件使得LNAs系统在体外检测中具有更广阔的应用前景［7］。目前LNAs主要在金属检测、适配体核酸支架筛选等工作中发挥重要作用［45，50-51］。

核糖开关是由非翻译区折叠成的具有特定构象的RNA序列，核糖开关在结合代谢物小分子之后的构象变化可以触发下游反应，对代谢通路产生影响。由此可知，核糖开关是小分子检测的最佳选择。Xu等［50］将Spinach 2与czcD核糖开关结合，创造了一种可以检测多种二价金属离子（铁、锰、钴、镍、锌）的荧光生物传感器。该核糖开关由一个代谢物识别区域和一个LNA区域组成（图3-A），当二价金属离子与识别区域结合时，构象变化导致一个新的茎环结构出现，从而使Spinach 2恢复与荧光团结合并增强发光的能力。这也是第一个可逆的Fe2+响应的基因编码荧光传感器。

细胞内复杂的环境会使LNAs无法正确折叠而完成成像工作，核酸支架可以帮助LNAs正确折叠且不被细胞内核酸酶水解。常见的核酸支架例如转运RNA支架，转运RNA即tRNA（transfer RNA），序列可折叠成紧密的立体构象，因此具有较高的结构稳定性。tRNA支架在使用时，需要我们将目标序列与tRNA序列连接在一起，实现共转录，重组的tRNA可携带目标序列免受酶水解带来的伤害［52］。LNAs系统在凝胶内成像方面的应用将有助于发现RNA支架［51］，总RNA电泳凝胶用荧光团染色，携带LNAs的片段发光。该方法可用于检测tRNA等RNA支架在细胞内的降解情况、开发RNA支架，可以显著提高LNAs的细胞内稳定性（图3-B）。此 外，LNAs系统还可以在Northern blot中作为SYBR Gold染料的替代，用已知的LNA作为核酸标签，之后使用荧光团溶液冲洗凝胶。这种染色方法不仅表现出与SYBR Gold法相同的灵敏度和高亮度，而且还能节约成本。

此外，LNAs系统在无细胞传感领域也有很大的应用潜力。无细胞传感器是通过细胞内各种反应的模块化组装获得的一种无需细胞支持即可实现快速检测的传感器。研究人员开发了一种基于LNAs系统的、配体诱导的RNA输出无细胞传感器（ROSALIND），用于水中污染物的检测（图3-C）。该传感器由RNA聚合酶、变构蛋白转录因子和DNA转录模板组成，以三路连接二聚体Broccoli和DFHBI-1T作为发光基础。当环境中存在目标污染物时，污染物结合到转录调控因子上，调控因子离开转录位点，诱导Broccoli的转录，Broccoli与环境中的DFHBI-1T结合产生荧光信号。目前ROSALIND已用于检测一系列水污染物，包括抗生素、小分子和金属离子［53］。

图3 LNAs系统在体外的应用Fig. 3 Application of LNAs system in vitro

3 总结与展望

从一次实验的意外发现到如今得到充分的开发与使用，LNAs已经走过了20年。与传统的细胞内成像探针或蛋白质标签相比，它们具有更稳定的结构和更强的光学特性。一些特定的富G序列会在一定条件下折叠形成高级结构——G四链体（G-quadruplex，G4），G4结构本身可以结合染料分子实现非特异性发光，例如小檗碱的非特异性发光［54］，但是作为FNAs的一种［55-56］，LNAs能以比G4更强的亲和力与特定靶分子结合［16，31，42，57］。在筛选方面，μIVC-SELEX和FACS-SELEX等具有高选择压力的选择模式可以帮助我们获得具有高亲和力和强光学性质的LNAs系统［10，27］。而在应用方面，LNAs可以直接嵌入靶核酸的侧边位置，在活细胞内实现快速准确的原位检测［23，58］，也可以与其他适配体或核糖开关联用，用于体外小分子物质的检测。

LNAs系统作为一种全新的检测工具，还面临着许多挑战，比如还需进一步探索其互作机制中不明确的部分：（1）筛选方法需优化。LNAs尤其是RLAs，需要在不被核酶降解的情况下，在复杂的体内环境中正确折叠。因此需要不断更新体内筛选方法。（2）机制未知，相互作用关系不明。荧光激活的机理比较清楚，但LNAs与荧光团之间的相互作用需要继续研究。（3）未知的细胞毒性。虽然后期研究中使用的荧光团的毒性不如最早的MG，但有必要充分了解它们的毒性。LNAs系统对细胞内RNA和蛋白质的影响尚不清楚。（4）应用广度不够。LNAs系统在胞内的研究较多，很少在体外和组织层面进行应用。解决上述问题将有助于开发更优的LNAs系统。

随着研究的深入与技术的进步，LNAs与靶分子的互作机制能够更加透明，应用将逐步从胞内转移到胞外，LNAs将会成为传感研究最有力的工具之一。