羧甲司坦缓释片的含量测定及体外释放度研究

钟晓娇 刘丽娜 王磊 肖婷婷 黄静

(贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550025)

羧甲司坦是一种黏液调节剂，具有明显抗炎、抑制氧化反应等作用[1]，目前广泛用于改善呼吸系统疾病[2]。由于羧甲司坦半衰期短，当前市售剂型均需一天多次给药，极大地降低了患者的顺应性和依从性，尤其是老年患者[3]。将羧甲司坦制成缓释剂型，不仅能减少患者服药次数，提高病患顺从性，同时也能使其在体内缓慢平稳的释放药物，避免出现峰谷现象，降低毒副作用，提高临床用药的安全性。本课题在前期研究基础上以羧甲司坦缓释片作为研究对象，采用UV测定其吸光度值，对其精密度、稳定性、专属性等进行考察；在含量测定方法建立的基础上对释放度测定方法进行选择，考察释放介质及pH、取样时间点及释放度，为羧甲司坦缓释片的处方筛选提供实验依据，并与市售羧甲司坦普通片的释放百分率比较，为羧甲司坦新制剂的研制提供参考。

1 仪器与材料

1.1实验仪器 UV-2700紫外可见分光光度计(岛津仪器(苏州)有限公司)，ZRS-8G 释放度试验仪(天津盛达三合光学仪器有限公司)，TD6 低速离心机(上海卢湘仪离心机有限公司)

1.2试药 羧甲司坦标准物质(批号：100246-201503，厂家：中国食品药品研究院)，羧甲司坦片(批号：161202，厂家：广东南国药业有限公司)，磷酸氢二钾(批号：20200322，厂家：广东·汕头市西陇化工厂)，磷酸二氢钠(批号：20200616，厂家：国药集团化学试剂有限公司)

1.3方法

1.3.1溶液配制 (1)pH=5.8磷酸盐缓冲液配制：称取磷酸二氢钾8.34 g与磷酸氢二钾0.87 g，加蒸馏水使混合溶解成1000 mL，即得。(2)人工胃液的配制：量取稀盐酸16.4 mL，加蒸馏水约800 mL与胃蛋白酶10 g，充分摇匀后，加蒸馏水稀释成1000 mL，即得。(3)pH=6.6磷酸盐缓冲溶液配制：分别称取磷酸二氢钠1.74 g，磷酸氢二钠2.70 g，氯化钠1.70 g，加蒸馏水至400 mL，溶解混匀即得。(4)pH=7.8磷酸盐缓冲溶液配制：取磷酸二氢钠2.76 g，加水溶解，并用蒸馏水稀释至100 mL，配成甲液。取磷酸氢二钠35.90 g，加水溶解，并用蒸馏水稀释至500 mL，配成乙液。取上述甲液17 mL与乙液183 mL混合，摇匀，即得。(5)对照品溶液的配制：精密称定羧甲司坦对照品10 mg，放入50 mL容量瓶中，加适量pH=6.6的磷酸盐缓冲液溶解，用磷酸盐缓冲溶液定容至刻度线，制得每1 mL中约含200 μg的溶液，即得。(6)空白溶液的配制：按处方比例精密称定各辅料适量，混匀，置250 mL容量瓶中，加缓冲液定容至刻度，超声10 min，以5 000 r/min的转速离心10 min，离心两次。取5 mL超声后的溶液置于50 mL容量瓶中，加缓冲液稀释至刻度。即得。(7)供试品溶液的制备：取自制羧甲司坦缓释片10片，研成细粉，取细粉适量。放入250 mL容量瓶中，加入pH=6.6的磷酸盐缓冲液定容至刻度，超声10 min，在5000 r/min，10 min的条件下离心，离心两次。取5 mL超声后的溶液置于50 mL容量瓶中，加入磷酸盐缓冲液稀释至刻度线制成每1 mL中约含200 μg的溶液。(8)2.0%茚三酮溶液配制：称取茚三酮2.00 g于100 mL量瓶，加适量乙醇溶解，定容，混匀即得。

1.3.2检测波长的测定 取供试品溶液、辅料溶液、对照品溶液各1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加pH=6.6的磷酸盐缓冲溶液1 mL，充分摇匀，水浴加热15 min，迅速冷却，蒸馏水定容至刻度线，以溶剂做空白对照[4]，在400～800 nm间扫描。

1.3.3标准曲线的制备 精密量取200 μg/mL的对照品储备液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加最终确定的释放介质1.8 mL，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加最终确定的释放介质1 mL，水浴加热15 min后，取出用冰水浴迅速冷却，蒸馏水定容至刻度线，以溶剂作空白对照，按UV在最大吸收波长处测定吸光度值。

1.3.4羧甲司坦缓释片含量的测定 分别取三批取羧甲司坦缓释片各10片，研细，精密称取0.5 g，置于250 mL容量瓶中，加入适量甲醇，加入pH=6.6磷酸盐缓冲液定容至刻度，超声20 min，以5 000 r/min离心10 min后，取5 mL溶液至50 mL容量瓶中，加pH=6.6缓冲液定容，取1 mL溶液至25 mL容量瓶中，加1 mL 2%茚三酮，加pH=6.6缓冲液1 mL，水浴加热15 min,迅速冷却，蒸馏水定容，在最大吸收波长处测定吸光度值。利用回归方程计算各样品的羧甲司坦含量。

1.3.5精密度实验 分别精密吸取羧甲司坦对照品溶液稀释成1.6、8.0和14.4 μg/mL的低、中、高浓度溶液各6份，加入2.0%茚三酮溶液0.4 mL，加入最终确定的释放介质1 mL，摇匀，水浴加热15 min，迅速冷却，蒸馏水定容，利用UV在最大吸收波长处测定吸光度值，其中日内精密度每隔2 h重复1次，连续测量6次，日间精密度每隔24 h测量1次，连续测3次，计算RSD值。

1.3.6稳定性实验 精密吸取羧甲司坦对照品溶液1 mL，置于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最终确定的释放介质1 mL，水浴加热15 min，迅速冷却，加蒸馏水稀释至刻度线，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h，12 h时利用UV在最大吸收波长处测定吸光度值，并计算RSD。

1.3.7重复性实验 精密吸取羧甲司坦对照品溶液6份，每份1 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最终确定的释放介质1 mL，摇匀，水浴加热15 min，迅速冷却，蒸馏水定容，利用UV在最大吸收波长处测定吸光度值，计算RSD值。

1.3.8回收率实验 精密称取羧甲司坦缓释片释放限度的30%、60%和100%的羧甲司坦对照品各3份，置50 mL量瓶中，分别加入处方比例的空白辅料[5]，各精密量取1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最终确定的释放介质1 mL，热水浴加热15 min，迅速冷却，用蒸馏水定容，利用UV在最大吸收波长处测定吸光度值，计算RSD。

1.4羧甲司坦缓释片释放度测定

1.4.1释放方法的选择 取羧甲司坦缓释片分别按释放度测定方法桨法和篮法操作，以最终确定的释放介质900 mL为释放介质，转速100 r/min，分别在最终确定的取样时间点时取样4 mL[6]，离心，取上清液1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最终确定的释放介质1 mL，充分摇匀，水浴加热15 min，迅速冷却，用蒸馏水定容至刻度线，利用UV在最大吸收波长处测定吸光度值。

1.4.2释放介质的选择 分别以pH=5.8、pH=6.6、pH=7.8的磷酸盐缓冲溶液、人工胃液作为释放介质的选择，按照最终确定的释放度法，转速为100 r/min，分别在最终确定的取样时间点取样4 mL，离心，取上清液1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，各对应的释放介质1 mL，充分摇匀，热水浴加热15 min，迅速冷却，用蒸馏水定容，利用UV在最大吸收波长处测定吸光度值。

1.4.3时间点的选择 缓释制剂至少取3个取样时间点，第一点在0.5～2 h，用于考察药物是否存在突释(释放量小于30%)；第二个取样时间点为中间取样时间点，药物释放约50%，用于确定释药特性；最后一个取样时间点在药物释放约80%取样，用于考察释药是否基本完全[7]。本课题拟采用时间点1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h。将羧甲司坦缓释片放入溶出杯中，转速为100 r/min，分别于1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h时取样4 mL，离心，取上清液1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最终确定的释放介质1 mL，充分摇匀，热水浴加热15 min，迅速冷却，蒸馏水定容，利用UV在最大吸收波长处测定吸光度值。

1.4.4羧甲司坦缓释片释放度测定 按《中国药典》2020年版收载的第二法释放度测定方法桨法：以pH=6.6的磷酸盐缓冲溶液900 mL为释放介质，转速100 r/min，取羧甲司坦缓释片及市售羧甲司坦普通片4 mL，离心，取上清液1 mL于25 mL容量瓶中，加入2.0%茚三酮溶液1 mL，加入最终确定的释放介质1 mL，充分摇匀，热水浴加热15 min，迅速冷却，蒸馏水定容至刻度线，利用UV在最大吸收波长567 nm处测定吸光度值，绘制缓释片和普通片的释放百分比-时间曲线图。

2 结 果

2.1检测波长的测定结果 羧甲司坦在567 nm处存在最大吸收，而溶剂和辅料在567 nm处无明显吸收，所以本实验测定羧甲司坦的检测波长为567 nm，见图1。

2.2标准曲线的制备结果 以吸光度值A为横坐标，以羧甲司坦浓度(μg/mL)为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程A=0.0695c-0.0898，相关系数r=0.9993，线性范围：1.6～14.4 μg/mL，羧甲司坦浓度在此线性范围内与吸光度值呈良好的线性关系，结果如图2。

2.3羧甲司坦缓释片含量测定结果 三批自制羧甲司坦缓释片的含量测定结果显示，不同批次羧甲司坦缓释片含量均在98%以上，表明羧甲司坦缓释片的含量符合要求，所建立的羧甲司坦缓释片的含量测定方法可靠。见表1。

表1 羧甲司坦缓释片含量的测定结果

2.4精密度实验结果 羧甲司坦溶液高中低浓度的平均吸光度值分别为0.028 μg/mL，0.466 μg/mL，0.921 μg/mL，RSD分别为1.87%，0.81%，0.74%，表明日内精密度良好。见表2。羧甲司坦溶液高中低浓度的平均吸光度值分别为0.027 μg/mL，0.465 μg/mL，0.920 μg/mL，RSD分别为2.0%，0.45%，0.17%，表明日间精密度良好。见表3。

表2 羧甲司坦缓释片日内精密度实验吸光度测定(μg/mL)

表3 羧甲司坦缓释片日间精密度实验吸光度测定(μg/mL)

2.5稳定性实验结果 羧甲司坦溶液的吸光度值的平均值为0.464，RSD值为0.42%，表明羧甲司坦样品溶液在放置12 h内测定，具有较好的稳定性。见表4。

表4 羧甲司坦稳定性实验结果(n=6)

2.6重复性实验结果 羧甲司坦溶液的吸光度值的平均值为0.465，RSD值为0.35%，表明该检测方法的重复性良好。见表5。

表5 羧甲司坦重复性实验结果(n=6)

2.7回收率实验结果 平均回收率为99.05%，RSD为1.8%，说明该方法测定羧甲司坦缓释片释放度的回收率良好，结果准确。见表6。

表6 羧甲司坦回收率实验结果(n=9)

2.8羧甲司坦缓释片释放度测定结果

2.8.1释放方法选择的结果 由图3结果可知，用篮法作为释放方法时，释放较缓慢，可能因羧甲司坦缓释片粘性较高，容易堵塞转篮的孔造成释放缓慢，而桨法释放速度相对转篮法快，而且释放速度相对稳定，因此选择用桨法作为测定羧甲司坦缓释片的释放方法。

2.8.2释放介质的选择结果 由图4结果可知人工胃液作为羧甲司坦释放介质时，吸光度值几乎为0，表明羧甲司坦在人工胃液中几乎不释放，而用磷酸盐缓冲溶液作为释放介质时吸光度值变化较大，说明羧甲司坦在磷酸盐缓冲溶液中释放，根据结果可知，当磷酸盐缓冲溶液pH=5.8和7.8时，吸光度值偏低，释放缓慢，当磷酸盐缓冲溶液的pH=6.6时，吸光度值较正常，符合药典要求，因此选择pH=6.6的磷酸盐缓冲溶液作为释放介质。

2.8.3时间点的选择结果 由表7结果可知，由于缓释制剂至少取3个取样时间点，第一点是开始0.5～2 h的取样时间点，第一个取样时间点定为1 h，第二个为2 h；中间取样时间点为4 h，用于确定释放是否完全的时间点是8 h，而4～8 h之间的吸光度值相差较大，所以中间加一个取样时间点6 h。由于10 h和12 h的释放百分比接近，因此10 h这个取样时间点舍去，最后一个取样时间点为12 h，此时药物释放接近100%。

表7 时间点的选择结果

2.8.4羧甲司坦缓释片释放度测定结果 利用UV在最大吸收波长567 nm处测定吸光度值。绘制缓释片和普通片的释放百分比-时间曲线图，见图5。与上市普通片相比，自制羧甲司坦缓释片体外缓释效果明显，推测缓释片可能延长羧甲司坦在体内的释放时间，减少用药次数，提高其生物利用度。同时，也表明试验制备的羧甲司坦缓释片体外释放特征良好，符合缓释片制备的有关要求。

用一级方程、Higuchi方程及零级方程对自制羧甲司坦缓释片的释放结果进行拟合结果，如表8所示。结果表明羧甲司坦缓释片的释放结果与一级方程方程拟合性最好，拟合方程为：ln(1-Mt/M∞)=-0.3102t+0.3082，相关系数r=0.9901。

表8 羧甲司坦缓释片的释药方程拟合结果

3 讨 论

缓释制剂的释药机制与其所用的缓释材料具有密切关系，其释药过程是缓释材料、水和药物等多重因素相互作用的结果。溶解度大的药物，释药机制主要表现为扩散；溶解度小的药物，释药机制主要表现为凝胶层的溶蚀，因此药物在水中的溶解性影响骨架片的释药过程[8]。

在释放度实验中，羧甲司坦缓释片相较于市售普通片，羧甲司坦缓释片可延缓释药速度，从而延长释药时间。其中，在释药前2 h时，羧甲司坦普通片的释药百分率已经达到95%以上，而羧甲司坦缓释片的释药百分率仅接近30%。羧甲司坦缓释片直到12 h 时释放百分比才到95%以上，说明释药时间明显延长，达到了缓释制剂的要求，且在这个释药过程中没有出现“突释”现象，达到药物缓慢释放的目的。

研究缓控释制剂药物释放机制时，通常采用数学模型对药物释放曲线进行拟合，然后根据拟合结果对释药机制进行推断[9]。一般可用零级方程、一级方程及Higuchi方程等拟合[10]，拟合时以相关系数r最大者为最佳拟合结果。由结果可知，一级方程的相关系数r最大(r=0.9901)，故自制羧甲司坦缓释片在释放介质中的释放机制接近一级释药模型。而零级方程的拟合相关性较差(r=0.9584)，说明该制剂释药方式不是单纯的扩散机制，可能为扩散与骨架溶蚀相协同的释药机制。

本课题建立的羧甲司坦缓释片的释放度测定及含量测定方法操作简单，方便，稳定，可靠，重现性好，可用于羧甲司坦缓释片释放度测定，自制羧甲司坦缓释片释放速度明显低于市售羧甲司坦片，其研发和生产成本较低，适合工业化生产，体外缓释效果明显，具有较大的临床应用价值，但其体内外相关性仍需进一步研究。