柑橘中农药多残留检测方法比对分析

贾惠言， 吴银良

(宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040)

随着城乡居民收入的提高和消费质量的改善，农产品消费需求正从“吃饱”向“吃好、吃得安全、吃得营养健康”快速转变，水果摄入量不断增加。柑橘为芸香科柑橘亚科柑橘属植物，其种类繁多，包括橙、橘、柚、柑、柠檬及其杂交后代等[1]。柑橘的果肉及果皮含有丰富的活性小分子[2-3]，兼具食用与保健功能。国家统计局数据显示，2019年我国柑橘产量为4 584.5万t，是我国产量最高的水果，占到水果产量的16.7%[4]。

农药在柑橘生产中应用普遍，而不规范的使用导致农药残留检出及超标问题频有发生，因此，柑橘中农药残留对生态及健康的影响备受关注[5-7]。Li等[8]分析了我国2 922份柑橘样品的农药残留情况，表明有86%的样品中存在40种不同的农药残留；林涛等[9]研究表明，丙溴磷、吡虫啉、啶虫脒、多菌灵、吡唑醚菌酯等农药在柑橘中的检出频次较高。因此，作为鲜食初级农产品，为保障居民健康及出口贸易，对柑橘进行农药残留检测十分必要。

目前，农产品中农药残留的检测方法主要采用气相色谱法、液相色谱法及色谱质谱联用法等，按照GB/T 20769、GB 23 200.8等标准进行检测。色谱及色谱质谱联用法灵敏度和准确度高，但是样品上机检测前的处理步骤比较冗繁，且需要昂贵的仪器设备及专业技术人员，不能满足农产品在政府监管和生产经营消费者自查等方面的需求[10-12]。我国已颁布标准的酶抑制率法受乙酰胆碱酯酶特异性的影响，检测的农药种类有限，仅用于有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测[13-15]，且该方法的检出限不能满足《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》(GB 2763—2019)[16]中规定的果蔬中农药最大残留限量要求，稳定性和重复性也差[17]。为提高监管与检验效率，亟需开发具有特异性强、灵敏度符合要求、样品前处理步骤简单、快速及低成本的农药残留快速检测方法。基于抗原抗体特异性识别的胶体金免疫层析技术可检测的药物种类更多，而且具有简单、快速、准确和特异性强等优点，可满足快速分析检测的需要，并易于在农场和市场普及推广，尤其适宜现场筛选和大量样品的快速分析，但目前生产的检测试纸种类较少[18]。

综上所述，本研究以柑橘作为研究对象，根据宁波市农产品质量检测中心历年对柑橘农药残留的监测结果，以挑选检出频次较高的4种农药(嘧菌酯、啶虫脒、吡虫啉、多菌灵)及国内市场抽检常超标的丙溴磷作为目标物，分别制备5种农药的胶体金免疫层析试纸条，并组装成柑橘5联农药速测卡，最后比较超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS法)与胶体金免疫层析快速检测法的灵敏度、精密度及实际样品的检测结果。

1 材料与方法

1.1 材料

嘧菌酯、啶虫脒、吡虫啉、丙溴磷及多菌灵完全抗原及其单克隆抗体及颗粒直径25 nm的胶体金溶液(中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所)；上述5种农药标准品(农业农村部环境质量监督检验测试中心)；乙腈(色谱纯，德国 Merck公司)；无水硫酸镁、氯化钠(分析纯，杭州瓶窑和顺化工试剂厂)；N-丙基乙二胺(primarysecondary amine，PSA)；填料(40～63 μm，北京安谱公司)；甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国Aladdin公司)；0.22 μm有机滤膜(天津津滕公司)；玻璃纤维纸(中国奥斯龙公司)；硝酸纤维素膜(NC膜，美国Millipore公司)；样品垫、PVC底板、吸水垫(上海杰一生物科技有限公司)；氯化钠、柠檬酸三钠、碳酸钾(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；柑橘(宁波市农产品质量检测中心)。

Acquity Xevo TQ-S型高效液相色谱-质谱联用仪(美国Waters公司);喷膜机(杭州峰航科技有限公司);切条机(杭州峰航科技有限公司);Avanti J-E高速冷冻离心机(美国BECKMAN COULTER公司)；BlueStar B紫外-可见分光光度仪(北京莱伯泰科仪器有限公司)；Milli-Q去离子水发生器(美国Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 胶体金标记抗体

采用目测法及分光光度法确定胶体金标记抗体的最适pH和最适稳定量，以分光光度法的测定结果为准[19-20]。将抗体置入透析袋中，在去离子水或极低浓度的盐水(0.005 mmol·L-1NaCl，pH 7.0)中进行透析，中间换3次透析液。10 000 r·min-14 ℃离心60 min后除去抗体沉淀，取上清液备用。Foubert等[21]用K2CO3调节胶体金溶液pH，然后加入用Tris缓冲液(pH 8.5，10 mmol·L-1)稀释的抗体反应15 min，加入牛血清白蛋白(BSA)溶液,胶体金/BSA=40/1(V∶V)，剧烈搅拌混合物10 min。将金标抗体以3 000 r·min-1、4 ℃离心10 min，弃去沉淀；将上清以12 000 r·min-1、4 ℃离心1 h，弃上清；沉淀用10-1原体积的含有1% BSA和1%蔗糖的10 mmol·L-1Tris缓冲液溶解，4 ℃保存备用。

1.2.2 胶体金免疫层析试纸条制备条件优化

选择常用的二抗浓度(0.5 mg·mL-1)喷质控线，胶体金抗体稀释比例选择常用的1∶5，如果预实验结果C线颜色浅，则升高浓度与比例。包被抗原用0.01 mmol·L-1pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)稀释成3个浓度梯度(嘧菌酯、吡虫啉、多菌灵为0.60、0.30、0.15 mg·mL-1，啶虫脒为0.40、0.20、0.10 mg·mL-1，丙溴磷为1.00、0.50、0.25 mg·mL-1)，用三维喷点平台喷于硝酸纤维素膜上作为检测线；用确定的抗原浓度喷检测线，胶体金抗体稀释比例选择常用的1∶5，把羊抗兔IgG稀释成3个浓度梯度(嘧菌酯、丙溴磷、多菌灵为1.00、0.50、0.25 mg·mL-1，啶虫脒为0.80、0.40、0.20 mg·mL-1，吡虫啉为2.00、1.00、0.50 mg·mL-1)，用三维喷点平台喷于同一硝酸纤维素膜的不同部位作为质控线；检测线与质控线相距5 mm，并做上标记以防止制作试纸条时贴反方向，制作成试纸条，根据试纸条测试结果确定检测线、质控线的最适印迹量。以抗原和二抗的最适印迹量喷于硝酸纤维素膜，取出干燥后裁成2.5 cm×4 mm大小的长条，将金标抗体按照3个不同稀释度吸附于结合垫上制作成试纸条(嘧菌酯、丙溴磷、多菌灵为1∶2、1∶4、1∶8，啶虫脒为1∶2、1∶5、1∶10，吡虫啉为1∶1、1∶2、1∶5)，进行系列浓度的各农药标样方阵试验。根据显示鲜红色的程度，确定最适金标记抗体稀释度。

1.2.3 胶体金免疫层析试纸条的组装

包被抗原用碳酸盐缓冲液(0.01 mmol·L-1CBS，pH 9.6)稀释，羊抗兔IgG用磷酸盐缓冲液(0.01 mmol·L-1PBS，pH 7.4)稀释，用三维喷点平台喷于硝酸纤维素膜上，作为检测线和质控线(两线相距5 mm，并做标记，以防制作试纸条时贴反方向)，取出干燥，裁成2.5 cm×4 mm的长条备用。将金标抗体吸附于结合垫，干燥后备用。

取PVC板，先撕掉黏贴硝酸纤维素膜部位的纸条，裁取相应长度的硝酸纤维素膜黏贴在塑料板上，然后取吸附好金标抗体的玻璃纤维贴于相应部位，要压住硝酸纤维素膜，再黏好吸水材料和未吸附金标抗体的玻璃纤维纸，将5个试纸条按农药名称分别放入5联卡槽中对应位置。

1.2.4 样品前处理

UPLC-MS/MS法。称取柑橘样品(已匀浆)5.00 g于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入20.0 mL乙腈，振荡提取30 min后，于9 500 r·min-1离心3 min。在15 mL聚四氟乙烯离心管中准确称量100 mg PSA和200 mg无水硫酸镁，加入3 mL上清液，振荡提取30 min后离心。在2 mL离心管中分取0.1%甲酸溶液0.5 mL，加入0.5 mL上清液，混合均匀，通过0.22 μm尼龙滤膜后待测。

免疫层析法。由于多菌灵、丙溴磷、吡虫啉在水中溶解度低，因此，在0.01 mol·L-1、pH 7.4的PBS中加20%甲醇作为样品提取液。称取已匀浆的柑橘样品2.00 g，以加入5 mL提取液、振荡2 min、静置3 min作为待测液。

1.2.5 检测方法

UPLC-MS/MS法。(1)液相参数。流动相为0.1%甲酸溶液(A)与色谱纯乙腈(B)，采用梯度洗脱条件进行分离。0～0.5 min，流动相为50%A+50%B；0.5～0.6 min，B相由50%线性升为90%，A相由90%线性降为10%；0.6～4.5 min，流动相为90% B+10%A；4.5～4.6 min，B相由90%线性降为50%，A相由10%线性升为90%；4.6～6.0 min，流动相为50% B+50%A。色谱柱为Acquity UPLC BEH C18，柱温35 ℃，样品室温度为15 ℃，流速为0. 3 mL·min-1，进样体积10 μL。(2)质谱参数。电喷雾离子源，正离子扫描ESI(+)，多反应监测(multiplereactionmonitoring，MRM)模式；电离电压为3.00 kV，雾化温度为500 ℃，雾化气流速为1 000 L·h-1，源温为150 ℃，锥孔气流速为150 L·h-1。嘧菌酯母离子404.11m/z，子离子分别为329.07m/z和372.17 *m/z(定量离子)，驻留时间为0.025 s，锥孔电压为20 V，碰撞电压分别为48和22 eV；啶虫脒母离子223.2m/z，子离子分别为90m/z和125.9 *m/z(定量离子)，驻留时间为0.025 s，锥孔电压为26 V，碰撞电压分别为32和20 eV；吡虫啉母离子256.1m/z，子离子分别为175.1m/z和209.1 *m/z(定量离子)，驻留时间为0.025 s，锥孔电压为22 V，碰撞电压分别为18和36 eV；丙溴磷母离子374.9m/z，子离子分别为304.9m/z和346.7 *m/z(定量离子)，驻留时间为0.025 s，锥孔电压为34 V，碰撞电压分别为15和10 eV；多菌灵母离子192.0m/z，子离子分别为132.0m/z和159.9 *m/z(定量离子)，驻留时间为0.025 s，锥孔电压为24 V，碰撞电压分别为28和18 eV。

免疫层析法。将速测卡水平放置，用滴管吸取前处理液上清(尽量不吸到果肉和果皮)，在加样孔中滴加3～4滴待测液，反应8～10 min，若T线颜色出现，结果为未检出(阴性)；若T线不显色，结果为检出(阳性)；若T线、C线均不显色则检出结果无效。

1.2.6 灵敏度试验比较

UPLC-MS/MS法。用制备好的柑橘基质空白液与0.1%甲酸溶液(5∶5，V∶V)进行稀释，分别移取10 mg·L-1上述5种农药标准中间溶液，用柑橘基质空白液进行梯度稀释，嘧菌酯、啶虫脒、吡虫啉、丙溴磷均配成0.050、0.010、0.005、0.001、0.000 5 mg·L-1的系列标液，多菌灵配成0.50、0.10、0.010、0.005、0.001 mg·L-1系列标液，绘制基质标准曲线。

免疫层析法。柑橘空白样品中加入样品提取液，振荡2 min，静置3 min，取上清液作为标准品稀释液。嘧菌酯的稀释浓度为10.0、5.0、1.0、0.2、0.1、0.02 mg·L-1，啶虫脒添加浓度为50.0、20.0、10.0、2.0、0.5、0.1 mg·L-1，吡虫啉添加浓度为30.0、7.5、1.5、0.3、0.06、0.015 mg·L-1，丙溴磷添加浓度为25.0、5.0、1.0、0.2、0.04、0.01 mg·L-1，多菌灵添加浓度为30.0、7.5、1.5、0.3、0.06、0.01 mg·L-1，每组均设置空白对照。根据1.2.5进行检测，根据实验结果确定试纸条的最低检出限。

1.2.7 精密度与准确度试验比较

UPLC-MS/MS法。用添加回收试验衡量分析方法的精密度和准确度，5种农药添加浓度均为0.010、0.10、1.0 mg·kg-1，每个浓度重复5次。

免疫层析法。精密度组柑橘空白样品各取5.0 g，分别加入检出限浓度的嘧菌酯、啶虫脒、吡虫啉、丙溴磷、多菌灵标准品，重复3次，按照1.2.5所述方法进行检测。准确度组根据《食品快速检测方法评价技术规范》要求，分别对20份柑橘阳性样品(添加不小于检测限的农药标准品)和20份柑橘阴性样品进行检测，通过数据分析速测方法的假阴性率和假阳性率，评价其与UPLC-MS/MS的一致性。对20份柑橘抽检样品进行速测结果与仪器定量检测结果比对分析，进行速测卡方法准确性数据分析。

假阴性率=假阴性数/总阳性数×100%，其中，总阳性数=阳性数+假阴性数；

假阳性率=假阳性数/总阴性数×100%，其中总阴性数=阴性数+假阳性数；

准确率=(阳性数+阴性数)/总数×100%。

2 结果与分析

2.1 胶体金标记抗体最适pH与最适稳定量

通过目测法与分光光度法检测胶体金标记抗体时的最适pH和最适浓度，以分光光度法得出的最适稳定浓度计算抗体实际用量。实际抗体用量=最适抗体浓度(μg·mL-1)×抗体体积(mL)/胶体金体积(mL)×(1+20%)。表1总结了胶体金标记5种农药抗体的最适pH、最适抗体浓度及最适稳定量。

2.2 试纸条检测线、质控线及结合垫包被量优化

对梯度稀释用于检测的完全抗原、二抗及金标抗体进行系列浓度的各农药标样方阵试验，根据显示鲜红色的程度，确定检测线上的抗原包被量、质控线上的二抗包被量及结合垫上金标抗体的包被量。由表2可知，嘧菌酯检测抗原包被浓度为0.30 mg·mL-1，二抗包被浓度为0.50 mg·mL-1，金标抗体稀释比例为1∶4；啶虫脒检测抗原包被浓度为0.20 mg·mL-1，二抗包被浓度为0.40 mg·mL-1，金标抗体稀释比例为1∶5；吡虫啉检测抗原包被浓度为0.60 mg·mL-1，二抗包被浓度为1.00 mg·mL-1，金标抗体稀释比例为1∶2；丙溴磷检测抗原包被浓度为0.50 mg·mL-1，二抗包被浓度为0.50 mg·mL-1，金标抗体稀释比例为1∶4；多菌灵检测抗原包被浓度为0.30 mg·mL-1，二抗包被浓度为0.50 mg·mL-1，金标抗体稀释比例为1∶4。

表1 胶体金标记抗体最适pH及最适稳定量测试结果

表2 试纸条抗原、二抗及金标抗体包被量方阵试验结果

2.3 待检农药在不同检测方法下灵敏度对比

UPLC-MS/MS法。表3显示，根据线性方程，嘧菌酯、啶虫脒、吡虫啉、丙溴磷的浓度线性范围在0.000 5～0.050 mg·L-1，多菌灵在0.001～0.50 mg·L-1。柑橘基质标准液浓度与峰面积线性关系良好，相关系数在0.998 6～0.999 9。

表3 各农药线性回归方程、相关系数和线性范围

免疫层析法。用柑橘空白样品提取液稀释系列浓度的农药标准品，按照1.2.5步骤进行检测，确定试纸条的最低检出限。由表4可知，嘧菌酯、啶虫脒、吡虫啉、丙溴磷、多菌灵试纸条的最低检出限分别为0.2、0.5、0.3、0.2、0.3 mg·kg-1。

表4 试纸条灵敏度检测结果

2.4 待检农药在不同检测方法下的准确度与精密度

UPLC-MS/MS法。表5显示，多菌灵的添加水平为0.10～1.00 mg·kg-1，其他4种农药在柑橘中的添加水平均为0.010～1.0 mg·kg-1。嘧菌酯平均回收率为78%～91%，相对标准差均小于7.0%；啶虫脒平均回收率为79%～103%，相对标准差均小于1.2%；吡虫啉平均回收率为88%～95%，相对标准差均小于1.3%；丙溴磷平均回收率为73%～78%，相对标准差均小于3.1%；多菌灵平均回收率为87%～95%，相对标准差均小于5.0%。

免疫层析法。表6显示，向精密度组柑橘空白样品分别加入检出限浓度的嘧菌酯、啶虫脒、吡虫啉、丙溴磷、多菌灵5种农药标准品，3批次试纸条的结果一致，精密度良好。

准确度组分析快速检测方法验证了柑橘样品中5种农药检测结果的准确率，以及速测方法的假阴性率和假阳性率。由表7可知，阴性样本快速检测试纸法的结果与抽检样本属性完全一致，测试结果均为阴性，5种农药的速测结果均无假阳性，准确率达100%。阳性样本中，嘧菌酯的假阳性率为10%，准确率为90%；啶虫脒、丙溴磷的假阳性率为5%，准确率为95%；多菌灵、吡虫啉的假阳性率为0，准确率为100%。

表5 柑橘中5种农药的添加回收率

表6 免疫层析法检测柑橘中5种农药精密度结果

3 小结

该研究针对柑橘中检出率高的4种农药(嘧菌酯、多菌灵、啶虫脒、吡虫啉)及常超标的中高毒农药丙溴磷制备胶体金免疫层析试纸条，并合并成5联速测卡。结果显示，这5种农药在柑橘中用免疫层析法检测的灵敏度均不高于GB 2763—2019中规定的最大残留限量(MRL)，柑橘中嘧菌酯、啶虫脒、吡虫啉、丙溴磷、多菌灵的MRL分别为1.0、0.5、1.0、0.2、5.0 mg·kg-1。但检测灵敏度明显低于超高效液相色谱串联质谱的方法。免疫层析速测卡的优点在于检测方法简便，基质效应低[22]，样品提取液可同时提取上述5种农药，并可在15 min内获得结果，其检测结果假阴性率为0%，假阳性率为0～10%，与仪器检测结果符合率为100%。综上所述，该速测卡可对柑橘中5种常见农药残留同时快速定性检测，基本可满足农户对这5种高风险农药的源头自检，在为确定采收时期提供依据的同时，减少农药超标，确保柑橘上市售卖，对保障柑橘的安全食用、消费者的健康和生态环境具有重要意义。

表7 柑橘不同样本的速测结果