白术内生真菌AM569对3种镰刀菌的拮抗作用及其ITS分子鉴定

吴启婷， 任航洁， 秦晔， 徐丹， 王雪怡， 秦路平， 朱波

(浙江中医药大学 药学院，浙江 杭州 310053)

药用白术为菊科植物白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根茎[1]，始载于《神农本草经》，被列为上品，性温、味苦，入脾、胃经，具健脾益气、燥湿利水、止汗安胎等功效，临床多用于脾虚食少、痰饮眩悸、腹胀泄泻、水肿、自汗、胎动不安等症状[2]。现代药理学研究表明，白术具有保肝、促进肠胃蠕动、治疗便秘、溃疡性急肠炎、提高免疫功能、增强脂代谢，抗炎抗肿瘤、降血糖等药理活性[3]。

内生真菌是指在生活史的某一个阶段能侵染并定殖在健康植物组织内部，且不会引起宿主植物明显病症的一类真菌[4]。近年来研究表明，几乎所有的植物体内都存在着内生真菌，植物内生真菌与宿主植物协同进化，互惠共生，在植物生长发育、抗逆胁迫等方面发挥着重要作用[5-6]。研究表明，部分植物内生真菌对植物病原菌具有拮抗作用。周春元等[7]从健康人参叶片中分离得到的一株优势内生真菌FS-01(球毛壳菌Chaetomiumglobosum)，其对人参黑斑病菌具有较强的抑制作用。杨涛等[8]从华重楼种子中分离到了一株内生真菌聚多曲霉jdqmzz-1(Aspergillussydowii)，其对根腐病病原菌尖孢镰刀菌、软腐病病原菌胡萝卜软腐果胶杆菌具有较好的拮抗作用。

根腐病是白术生产栽培中主要的土传性病害之一，危害严重，是白术生产种植链中亟待解决的问题。白术根腐病病原菌为复合性病原菌，主要为镰刀菌属真菌，包括尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)和半裸镰刀菌(Fusariumincarnatum)等[9]。目前，栽培管理中白术根腐病主要依靠化学农药防治，易导致环境污染、农药残留以及病原菌耐药性等问题[10]。因此，本试验在前期分离得到的32株白术内生真菌的基础上，采用平板对峙法考察内生真菌对3种根腐病病原菌的拮抗作用，进一步选取活性菌株进行发酵产物制备，考察发酵产物对根腐病病原菌的拮抗作用，并最后对活性菌株进行ITS分子鉴定，以期为白术根腐病的生物防治提供备选菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

课题组前期从白术新鲜组织中分离纯化得到32株内生真菌。白术根腐病病原菌尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum，FO)、腐皮镰刀菌(Fusariumsolani，FS)、半裸镰刀菌(Fusariumincarnatum，FI)由浙江农林大学陈杰研究员惠赠。

1.1.2 仪器与试剂

SW-CJ-2D垂直型超净台(中科星宇科技发展有限公司)；LDZX-50KBS型高压灭菌锅(山东博蓝达机械有限公司)；B2-25型恒温摇床(上海立德泰勀科学仪器有限公司)；PN-CCS 10 L型超纯水仪(美国Millipore公司)；DHG-9031A型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信试验仪器有限公司)；FA2004型电子分析天平(上海恒平精密电子仪器有限公司)；TC1000-S型PCR仪(上海艺斯高贸易有限公司)；HC-1016/1014型高速离心机(上海浦东天本离心机械有限公司)；海尔BCD-258WDPM型冰箱(青岛海尔股份有限公司)；DYCZ-25D型电泳仪(南京金斯瑞生物科技有限公司)；ZF-268型凝胶成像系统(北京原平皓生物技术有限公司)；FYL-YS真菌培养箱(北京福意联医疗设备有限公司)。

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基(1 L)组成为：土豆200 g、琼脂15 g、葡萄糖20 g、青霉素钠50 mg、纯水1 000 mL。PDB液体培养基(1 L)组成为：土豆200 g、葡萄糖20 g、青霉素钠50 mg、纯水1 000 mL。其余试剂包括NaClO溶液，乙醇，葡萄糖，DNATaq酶，脱氧核糖三磷酸(dNTP)，MgCl2，10×PCR反应缓冲液等。

1.2 方法

1.2.1 病原菌与内生真菌的平板对峙

采用平板对峙法考察32株内生真菌对3种白术根腐病病原菌(FO，FS，FI)的拮抗活性。在PDA平板中央接种直径为5 mm的病原菌菌块，以120°为夹角，在距病原菌菌株20 mm的3个直线方向的等距位置接种直径为5 mm的内生真菌菌块，以不接种内生真菌的病原菌平板为空白对照，待对照组病原菌长满平板后，测量各组病原菌菌落直径，计算抑菌率=(对照组病原菌菌落直径-处理组病原菌菌落直径)/对照组病原菌菌落直径×100%，试验重复3次。

1.2.2 AM569发酵产物的制备

挑取AM569菌株单菌落接种于马铃薯葡萄糖水(PDB)液体培养基中，在26 ℃、180 r·min-1恒温条件下摇床振荡培养8 d。取发酵液抽滤，将滤液以乙酸乙酯∶滤液1∶1的比例萃取3次，旋蒸至浸膏状。同时，将菌丝放置于50 ℃烘箱中烘至恒重，研磨成粉末，以甲醇(mL)∶菌丝粉末(g)20∶1的比例超声提取1 h，抽滤得菌丝甲醇提取液。将菌丝甲醇提取液与发酵滤液浸膏混合，适量甲醇超声溶解，旋蒸至浸膏状，加入适量二甲基亚砜(DMSO)助溶，用甲醇定容至10 mL，即得AM569发酵产物。

1.2.3 AM569发酵产物抑菌活性检测

取AM569浸膏加入PDA固体培养基中(浓度为10 mg·mL-1)，在平板中央接种直径为5 mm的3种病原菌菌株，设10 mL无菌水为阴性对照组，多菌灵500倍液为阳性对照组，5 mL DMSO+5 mL甲醇为阳性溶剂对照组，计算抑菌率，试验重复3次。

1.2.4 AM569的ITS分子鉴定

使用真菌基因组DNA提取试剂盒，以无菌水冲洗3次菌丝体，进行冷冻干燥，提取AM569的DNA[11]。采用通用引物ITS4(5′-GGAAGTAA AAGTCGTAAGG-3′)与ITS5(5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3′)进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，得到的序列在NCBI GenBank数据库中搜索同源序列，并进行BLAST比对，用于系统发育分析[12]，使用Mega7.0软件进行系统发育树构建[13]，明确AM569的系统分类地位。

2 结果与分析

2.1 病原菌与拮抗菌的对峙结果

在32株白术内生真菌中，对FO、FS、FI病原菌有抑制作用的内生真菌分别有9株、11株、21株，占比分别为28.1%、34.4%、65.6%；共26株内生真菌至少对一种白术根腐病病原菌具有抑制作用，占总数的81.2%。对3种病原菌均有抑制作用的内生真菌共3株，为AM171、AM262和AM569；其中，AM569综合抑菌效果最好，对FO、FS、FI抑菌率分别为74.3%、77.5%和70.4%(表1，图1)。

2.2 AM569发酵产物抑菌活性检测

AM569发酵产物对3种白术根腐病病原菌FO、FS、FI的抑菌率如表2所示。AM569、多菌灵对病原菌FO、FS的抑菌率都是100.00%，与无菌水对照组均有显著性差异；溶剂DMSO+甲醇组对FO、FS组抑菌率分别为31.76%和68.24%，与AM569组、无菌水组均有显著差异。AM569对病原菌FI的抑菌率为100.00%，多菌灵对病原菌FI的抑菌率为23.53%，溶剂DMSO+甲醇组对FI的抑菌率为8.82%，与AM569组、无菌水组均有显著性差异(表2)。综上所述，AM569发酵产物对FO、FS、FI均具有显著的抑菌性(图2)。DMSO+甲醇溶剂对FS具有较强的抑菌作用，在后续试验中，针对FS应考虑乙醇等为提取溶剂，以减少溶剂对试验结果的干扰。

表1 对FO、FS、FI 3种病原菌的抑菌效果

2.3 内生真菌AM569的分子鉴定

将AM569序列在GenBank数据库中进行BLAST比对，下载与DNA序列相似的14个序列作为参考菌株序列，再选择Ditopellasp.(EU683067)作为外群，进行系统发育关系分析[14]。结果显示，AM569与Phomopsisasparagi(KX866925)、Phomopsiseucommii(AY601921)聚在一起，形成了一个支持强度为100%的末端分支(图3)，所以将AM569鉴定为拟茎点霉属(Phomopsissp.)真菌。

图1 AM06、AM569对3种白术根腐病病原菌的平板抑制作用

表2 AM569发酵产物对3种白术根腐病病原菌的抑菌活性

图2 AM569发酵产物对3种镰刀菌FO、FS、FI的平板抑制效果

图3 基于ITS序列的白术内生真菌AM569系统发育树

3 小结与讨论

本试验从32株白术内生真菌中筛选得到一株内生真菌AM569，其发酵产物对3种白术根腐病病原菌(Fusariumoxysporum，FO；Fusariumsolani，FS；Fusariumincarnatum，FI)具有显著的抑制作用。经ITS分子鉴定，AM56为拟茎点霉属(Phomopsis)真菌，该菌株已保存至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.21947。

近年来已报道许多具有拮抗病原菌作用的内生真菌，如蓝莓健康组织中分离纯化的枝孢菌属(Cladosporiumsp.)内生真菌BB01可抑制4种蓝莓病害菌生长[15]，从滇重楼块茎中分离的8株内生真菌对植物病原菌立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌有一定的抑制作用[16]。本试验发现白术内生真菌对白术根腐病致病菌有显著的抑菌性，可进一步研究开发微生物农药，利用生物防治手段科学有效地防控白术根腐病，提高白术药材的产量和品质。植物内生真菌发酵产物往往具有较好的抗病原菌作用，如来源于核桃树根部的一株内生真菌G3(Fusariumcamptoceras)，其发酵产物对苹果腐烂病原菌、水稻纹枯病原菌、核桃炭疽病原菌均表现出良好的抑菌活性[17]。苦参内生真菌BS001(Aspergilluterreus)对黄瓜枯萎病菌具有显著的抑菌效果，BS001菌株发酵液中的抗菌活性物质能抑制黄瓜枯萎病菌丝的生长，同时抑制孢子萌发，对黄瓜枯萎病病原菌合成梭甲基纤维素酶有抑制作用，并且可以使细胞膜结构受损，从而能很好地抑制黄瓜枯萎病[18]。温郁金内生真菌ChaetomiumglobosumL18对玉米大斑病菌、禾谷镰孢菌等多种植物病原真菌均有不同程度的抑制作用，抑菌谱较广泛，可以通过侵入、穿透、缠绕等多种方式寄生于病原真菌菌丝，通过酶解作用破坏病原真菌细胞壁，导致病原真菌死亡[19]。

拟茎点霉属(Phomopsissp.)是半知菌亚门、腔孢纲、球壳孢目、球壳孢科(Annonaceae)的真菌，显著特征是分生孢子呈现二型性及仅有无性生殖，该属已记录有100多个种，可寄生于70多个不同科的草本和木本植物[20]。拟茎点霉属真菌发酵代谢产物对许多种植物病原菌均具有良好的抑菌效果，其在防治农作物病害上具有广阔的应用前景。李芙蓉等[21]从丹参中分离筛选得到的拟茎点霉属真菌(Phomopsissp.S4)，其发酵液提取物可以对稻瘟病菌丝的细胞壁造成破坏，从而干扰了菌丝正常的生理功能，进而抑制了稻瘟病菌的生长。

本试验发现，从白术中分离得到的拟茎点霉属内生真菌AM569对白术根腐病菌具有较强的抑菌活性，具有较大的开发应用价值，为今后生物防治白术根腐病的微生物制剂开发奠定基础。下一步拟对AM569发酵产物中的活性物质进行分离鉴定，以寻找目标活性化合物，为微生物菌剂的开发与利用提供优质的先导活性物质。