基于生物信息学筛选影响Ⅲ期结肠癌患者预后相关基因

陈 国，田黎民，李晓平

（1.广东省汕头潮南民生医院肿瘤综合外科，汕头 515154；2.湖北恩施土家族苗族自治州中心医院病理科，恩施 445000；3.广东省江门市中心医院胃肠外科，江门 529000)）

据统计，截至2020年美国每年结肠癌新发病例147 910例，死亡53 200例；我国结肠癌年新发病例约376 000例，死亡191 000例[1-2]。结肠癌已经成为最常见的消化道恶性肿瘤，严重威胁着人类健康。肠癌一旦发生区域淋巴结转移，则定义为Ⅲ期，而Ⅲ期肠癌的术后辅助治疗是基于5-氟尿嘧啶和奥沙利铂为基础的化疗方案。纵使接受了标准疗程的辅助治疗，仍有40%以上的患者出现复发转移[3-4]。分辨出Ⅲ期结肠癌患者中的高危患者、寻找潜在的治疗靶点具有重要意义。但目前针对Ⅲ期结肠癌的研究非常有限，本研究拟根据生物信息学方法，通过大数据平台筛选出影响Ⅲ期结肠癌患者预后的关键基因，以便为后续的实验室研究提供相应的靶基因。

1 材料与方法

1.1 筛选患者相关数据

下载并筛选Ⅲ期肠癌患者的转录组核糖核酸测序（RNA-seq）数据和临床预后信息。从TCGA（https：//www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）数据库中收集所有结肠癌患者RNA-seq数据和相关临床数据信（肿瘤位置包括升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠）[5]。从中筛选出临床分期为Ⅲ期的患者，共筛选出126例Ⅲ期结肠癌的患者，包含126例结肠癌的癌组织和8例癌旁组织。

1.2 筛选差异表达基因

NetworkAnalyst（https：//www.networkanalyst.ca）是一个专门用于转录组基因表达数据分析的在线网站[6]。在该网站中，以P＜0.01以及|logFC|≥1为条件筛选出Ⅲ期结肠癌患者的癌组织和癌旁组织的差异表达基因。通过该网站绘制出描述差异基因表达情况的火山图。

1.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

对1.2中筛选出的差异基因进行功能富集分析和KEGG通路富集分析。具体步骤如下：首先，从NetworkAnalyst网站中得到差异表达基因的基因名称，通过Ensembl数据库，将所有差异表达基因的基因名装换为Gene symbol形式。其次，通过可视化数据分析网站（the Database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID）对差异基因进行功能分析（https：//david.ncifcrf.gov/）[7]。P＜0.01表示富集分析差异有统计学意义。基因本体论（gene ontology，GO）功能富集分析结果主要包括生物学的分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biology process，BP）和细胞成分（cellular component，CC），而KEGG通路富集分析则用于分析差异表达基因的信号通路。

1.4 PPI网络构建以及模块分析

首先，利用蛋白质相互作用数据库（https：//www.string-db.org/）构建之前筛选出的差异表达基因，并构建PPI网络图，将可信度≥0.7作为筛选条件[8]；其次，利用Cytoscape软件将差异基因的蛋白质相互作用网络图可视化；最后，利用Cytoscape软件上筛选出PPI网络图上的核心模块和核心基因。

1.5 核心基因的生存分析

在RNA序列表中找到所有Ⅲ期结肠癌患者核心基因的表达值，计算每个核心基因的中位值并以此为临界值，把Ⅲ期结肠癌患者高表达组和低表达组，利用Graphpad软件绘制患者每个基因的Kaplan-Meier生存曲线，P≤0.05提示该基因的高低表达组中对生存影响具有统计学意义。

1.6 分析与预后相关的基因突变位点

利用cBioPortal数据库（www.cbioportal.org）来显示基因突变的频率（基因的扩增、突变、拷贝数增加以及基因的缺失）[9]，所有操作步骤均按照cBioPortal网站在线操作指南进行。

2 结果

2.1 基本临床资料

126例Ⅲ期结肠癌患者中，其中男性62例（49.21%），女性64例（50.79%）；平均年龄为（65.32±13.88）岁；有淋巴脉管浸润者95例（75.40%）；T分期中T2、T3、T4分别为10例（7.94%）、100例（79.37%）、16例（12.70%）；N分期中N1、N2分别为77例（61.11%）、49例（38.89%）；腺癌104例（82.54%），黏液癌22例（17.46%）；临床分期中ⅢA、ⅢB、ⅢC期分别为31例（24.60%）、56例（44.44%）、39例（30.95%）。

2.2 差异基因的筛选

通过筛选TCGA下载的结肠癌患者数据，我们获得了126例Ⅲ期结肠癌的RNA测序数据和相关临床随访信息；我们利用NetworkAnalyst在线网站进行差异基因分析，比较了126个结肠癌组织与8个癌旁正常组织之间差异表达基因，共获得991个差异表达基因（以P＜0.01以及|logFC|≥1的筛选条件）。根据NetworkAnalyst网站这991个差异表达基因的表达情况以火山图的形式进行呈现，如图1所示。

图1 Ⅲ期结肠癌患者中差异表达基因

2.3 差异表达基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

为更好地了解上述筛选出的991个差异表达基因的功能，利用David对991个差异表达基因进行了GO功能富集和KEGG通路富集分析。BP富集结果显示差异基因主要富集于化学突触传递、多巴胺能神经元分化和离子跨膜转运（图2a）；CC结果表明，差异基因在胞外区、胞外间隙和核周体这些部位成分较为丰富（图2b）；MF结果表明，差异基因主要富集于分子结构活性、延迟钾通道活动和丝氨酸肽链内切酶活性（图2c）。同时，KEGG通路富集分析表明，差异基因在环磷酸腺苷（cAMP）信号通路和神经活性配体-受体相互作用相关通路中功能较为活跃（图2d）。

图2 差异表达基因的GO和KEGG通路富集分析

2.4 利用PPI蛋白相互作用网络寻找核心基因及核心模块

PPI蛋白质相互作用网络能够用来说明蛋白质之间的相互作用，本研究中，利用STRING数据库来构建991个差异表达基因的PPI蛋白相互作用网络图（图3a），利用最小相互作用分数≥0.7的条件筛选出了532个候选基因；为了找到差异表达基因之间的相互关系，利用Cytoscape软件以节点分数=0.2，K值=2.0作为筛选条件，筛选出了候选基因中相互作用最为密切的一个模块（图3b），通过筛选获得20个核心的基因，包括NPY、CASR、NPY2R、PENK、CCL16、SST、HTR1D、CXCL5、CNR1、PYY、CXCR5、PPBP、INSL5、P2RY4、P2RY12、GALR1、GNG8、GNG13、CHRM2以及TAS1R1基因。

图3 蛋白互助网络图

2.5 生存分析

分别计算上述20个基因在126例患者中的中位表达量，并以此作为介值，高于中位表达量的患者认为是高表达组，低于中位表达量的患者被认为是低表达组；据此将我们筛选出来的126例患者分为高表达组和低表达组。如图4所示，利用Kaplan-Meier生存曲线分析上述20个核心基因高表达组和低表达组的预后差异，P＜0.05为差异有统计学意义。结果发现患者高表达CXCL5或GNG13基因的预后较差，提示这两个基因可能是结肠癌的促癌基因。

图4 关键预后基因生存曲线

2.6 核心基因的突变位点分析

通过cBioPortal数据库分析CXCL5和GNG13基因发生错义突变、深度缺失和扩增几种突变情况的频率。结果显示CXCL5基因的突变率为1.7%，有7个突变位点，其中4个发生在IL-8结构域；GNG13基因的突变率为0.8%，有1个突变位点，g-γ结构域，见图5。

图5 在cBioPortal数据库中检测结肠癌患者CXCL5和GNG13基因的变化

3 讨论

近年来，结肠癌的发病率逐年升高[10]。然而，结肠癌起病隐匿、进展迅速、容易对化疗药物抵抗等因素导致结肠癌患者预后较差[11]。作为一种多因素疾病，结肠癌的发病机制复杂且尚未研究清楚，吸烟、饮酒、肥胖、缺乏锻炼以及基因突变等因素均会导致疾病的发生[12]。临床上，Ⅲ期肠癌被定义为存在区域淋巴结转移而没有合并远处转移的患者，此类患者的治疗方案为根治手术联合化疗。根据患者的临床病理因素可以将结肠癌分为高危组和低危组，选择不同的治疗方案，患者的预后情况也存在着明显差异。André等[13]研究认为，高危型患者需要采取8个疗程的化疗方案治疗，低危型患者则仅需要采取4个疗程的XELOX化疗方案进行治疗。但是多种基因与结肠癌的发生有关，单纯采用临床病理因素划分结肠癌患者的危险性，忽略了基因因素对结肠癌患者发病的影响。研究[14]显示，KRAS、NARS以及BRAF基因突变与患者预后有关，且能够指导患者的肿瘤靶向治疗；BRAF V600E的突变状态能够对预后进行分层，指导临床治疗；错配修复蛋白（MMR）以及微卫星不稳定性（MSI）的检测能够用于筛选Lynch syndrome患者，指导患者的治疗。也有关于人类表皮生长受体因子（HER2）与结肠癌患者关系的研究[15]。这些都说明基因在结肠癌患者的发病以及治疗中的重要作用。

本研究利用大数据模式，采用生物信息学方法，通过TCGA数据库筛选到126例Ⅲ期结肠癌患者，通过癌组织和癌旁组织的差异性分析，筛选出了991个差异基因，通过功能富集分析和KEGG通路富集分析，发现主要富集于cAMP信号通路和神经活性配体-受体相互作用相关通路。刘明心等[16]认为，cAMP信号通路与机体的应激、炎症、免疫及肿瘤的发生发展密切相关，通过靶向cAMP/PKA/CRE信号通路，有助于逆转肿瘤的发生。瞿根义等[17]发现神经活性配体-受体通路与前列腺癌的发生发展具有密切相关性。因而多个研究提示了cAMP信号通路与神经活性配体-受体通路与肿瘤的发生发展具有相关性，但在Ⅲ期结肠癌中的作用上不明确，值得后续研究探讨。

本研究通过蛋白质相互作用网络及MCODE分析法，筛选出20个关键的差异基因。通过生存分析发现，高表达CXCL5和GNG13的Ⅲ期结肠癌患者预后较差，提示这两个基因可能是促癌基因。CXCL5是趋化因子家族分泌的信号蛋白。CXCL5作为一种促炎症和促癌分子，可以介导多种细胞行为，包括肿瘤细胞的迁移和侵袭以及中性粒细胞的转运。CXCL5与多种肿瘤的发生发展有关[18]。Yu等[19]发现间充质基质细胞（MSCs）分泌的CXCL5可促进乳腺癌的转移。Kawagoe等[20]发现血清CXCL5水平可作为结直肠癌患者的预后指标，CXCL5可促进结直肠癌转移，高水平的CXCL5可导致肿瘤复发和预后不良。血管生成在恶性肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用，但CXCL5在Ⅲ期肠癌中仍缺乏相应研究，其内在的信号通路仍值得我们后续的实验室分析。GNG13是编码G蛋白亚基γ13的7-跨膜-螺旋G蛋白偶联受体的信号转导子。GNG13是一种γ亚单位，在视网膜、味觉和神经组织中均有表达，在味觉传导中起着关键作用。Ren等[21]发现，GNG13在多巴胺能突触信号通路中起重要作用，与本文的研究一致。GNG13是钙信号通路中的靶点与骨骼肌的发育有关，有助于维持体内平衡和再生。癌细胞的生长需要消耗大量的能量，钙离子保证了能量的供应，可能在一定程度上会促进肿瘤的进展。Yi等[22]推测GNG13可能通过细胞毒的抗癌作用抑制乳腺癌细胞。Sun等[23]发现GNG13是前列腺癌的中枢基因。查阅相应的中英文数据库，暂没有关于GNG13与结肠癌发生发展及预后的相关研究，提示了该基因是本研究首次发现并提出与Ⅲ期肠癌患者预后相关，因而在后续实验室研究中具有重要的研究价值。

当然，本研究具有一定的局限性。本研究是从生物信息学的角度发现了影响Ⅲ期肠癌患者的相关基因，仍需后续的实验研究进行功能验证及通路分析。

本研究通过生物信息学方法分析了公共数据库中Ⅲ期结肠癌患者转录组水平的mRNA表达情况及临床随访信息，发现CXCL5和GNG13可能是影响Ⅲ期结肠癌患者预后的促癌基因。