季节性放牧对牧草、牦牛瘤胃液和乳脂中脂肪酸组成的影响及其关联分析

姚喜喜 刘 温 徐成体 刘皓栋

(1.青海大学农牧学院，西宁810016；2.中国农业科学院北京畜牧与兽医研究所，北京100193；3.青海大学畜牧兽医科学院，西宁810016；4.甘肃畜牧工程职业技术学院，武威733006)

牦牛(Bosgrunniens)是我国高海拔地区繁衍的一种珍稀牛品种，牦牛乳是藏族人民最为重要的经济收入支柱[1]，也是我国宝贵的畜产资源[2]。长期以来，提高牛乳中脂肪酸(fatty acids，FA)的含量一直是科学研究的一个重要目标，因为某些脂肪酸与人类健康及改善奶制品的加工质量有关[3]，例如，共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA)作为一种新型功能性脂肪酸，其特殊的功效越来越受关注，天然共轭亚油酸主要存在反刍动物牛、羊等的脂肪及乳中，其中共轭亚油酸的2种异构体c9t11共轭亚油酸与t10c12共轭亚油酸的含量较高，并且具有抗癌、预防疾病、减脂降重等重要的生理功能。牛奶中50%的脂肪酸来源于血液，其余50%在乳腺中合成[3]。在乳腺中合成的脂肪酸往往是短链脂肪酸(C4～C14)，主要受动物遗传学的影响[4]。血液中的脂肪酸主要来源于饲粮或微生物，微生物来源的脂肪酸的含量和组成差异很大，以奇链和支链脂肪酸为代表[5]。

多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)已被证实与人类健康息息相关[6]。饲粮中的脂肪酸，尤其是PUFA，在瘤胃中经生物氢化作用易被分解，从而降低了它们在乳脂中的含量。植物因子可以影响生物氢化过程，控制瘤胃中的脂肪酸比例，从而控制牛奶中的脂肪酸比例[7]。放牧牦牛乳脂中PUFA含量受季节变化的影响，表现为盛草期含量最高，这可能与牧草中脂肪酸的组成和含量有关[8]。据报道，青绿牧草的比例以及饲喂方式会通过影响瘤胃内环境进而对乳脂中PUFA含量产生一定的影响[9-11]；碳水化合物含量较高的饲粮可增加瘤胃液总挥发性脂肪酸含量，降低瘤胃液pH，限制生物氢化作用，提高乳脂中PUFA含量[12-13]。据Chilliard等[3]报道，当精料占到饲粮的70%以上时，由于较低的瘤胃液pH限制了如亚油酸(c9,12-C18∶2，LA)和α-亚麻酸(c9,12,15-C18∶3，ALA)的生物氢化过程，PUFA含量会降低35%～50%。

本研究通过测定不同季节牧草与不同季节放牧青海大通牦牛瘤胃液和乳脂中脂肪酸组成，以期发现季节性放牧对牧草、牦牛瘤胃液和乳脂中脂肪酸组成的影响规律，为提高牦牛乳中PUFA含量和生产出更高品质的功能性牦牛乳产品提供理论支撑，同时也为预防和治疗某些现代常见疾病提供绿色、有效的食疗指导。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验以青藏高原高寒草原作为放牧区域，位于青海省海北州门源县境内(N37°29′～N37°45′，E101°12′～E101°23′)，气候属高寒湿润类型，年均气温-0.5～3.5 ℃，年均降水量545 mm，年蒸发量1 222 mm，以线叶嵩草(Kobresiacapillifolia)、针茅(Stipacapillata)和早熟禾(PoapratensisL.)为优势种牧草。

1.2 试验设计

从海北州周边牧户家庭牧场中选择生产节律相同的20头6岁的体重[(251.5±10.5) kg]相近、健康无病和产犊时间(3月下旬产犊)一致的放牧带犊大通泌乳母牦牛，在春季(4—6月)、夏秋季(7—9月)、冬季(10—12月)连续9个月放牧期间，每月中旬跟踪采集牧草、瘤胃液和乳样品，将同一季节3个不同月份的牧草、瘤胃液和乳样品作为平行样品代表每个季节状况，通过测定牧草和牦牛乳的营养品质，牧草、瘤胃液和乳脂的脂肪酸组成以及瘤胃发酵参数来揭示季节性放牧对牧草、牦牛瘤胃液和乳脂中脂肪酸组成的影响。整个试验周期为9个月(4—12月)，试验期间牦牛一直处于泌乳状态，犊牛随母牛自由放牧没有断奶，母牛体重基本维持不变。

1.3 样品采集方法

选择春、夏、冬3个季节采集牧草样品，样品采集时选取放牧植被均一的草地，在样地对角线上设置15个1 m×1 m的样方，先调查记录每个样方内植物物种数，后齐地面刈割每个样方内所有植物，分别装于已标号的信封袋，迅速带回实验室在105 ℃烘箱中杀青2 h后在65 ℃烘箱中烘至恒重，风干牧草在立体式粉碎机粉碎后过1 mm网筛，用于牧草营养品质和脂肪酸组成测定。

采集瘤胃液和乳脂时，将母牛与犊牛隔离一夜(防止哺乳)，于第2天08:00空腹采集。采集的乳样在50 mL离心管中保存；瘤胃液采集时将牦牛绑定放倒，使用口腔导管每头抽取50 mL瘤胃液，置于准备好的冰盒中带回实验室待测。

1.4 指标测定方法

牧草营养素含量测定方法[14]：牧草粗脂肪(ether extract，EE)含量采用索氏抽提法测定，粗蛋白质(crude protein，CP)含量采用全自动凯氏定氮仪(Foss Kheltec 8400)测定，酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)和中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)含量使用全自动纤维分析仪(ANKOM 2000)测定，粗灰分(Ash)含量采用灰化法测定，钙(Ca)含量采用高锰酸钾法测定，磷(P)含量采用钒-钼黄比色法测定。

牧草中脂肪酸组成测定方法：采用国标GB/T 17377—2008[15]中方法测定。仪器：日本岛津气相色谱仪(GC-2010 Plus，岛津，日本)。色谱条件：色谱柱规格100 m×0.25 mm×0.20 μm，载气种类为氮气，载气流速为1.3 mL/min，空气流量为405 mL/min，气体尾吹流量为28 mL/min，氢气流量为32 mL/min，后进样口温度为268 ℃，分流比为120∶1，前检测器温度为280 ℃。柱箱升温程序：第1阶段，初始温度150 ℃，保持12 min；第2阶段，以4 ℃/min升温至240 ℃，保持25 min，进样量为1 μL。将处理好的标准测定液及试样测定液装入专用玻璃瓶中，放入气相色谱仪操作盘中，排好顺序，设置工作程序，平行测定最少2次，以色谱峰面积对样品中各脂肪酸进行定量，每个样品测定3次，取平均值。

瘤胃液中脂肪酸组成测定方法：采用国标GB/T 17377—2008[15]中方法测定。色谱柱规格为100 m×0.25 mm×0.20 μm，载气种类为氮气，载气流速为1.2 mL/min，空气流量为450 mL/min，尾吹气流量为25 mL/min，氢气流量为40 mL/min，后进样口温度为250 ℃，分流比为30∶1，前检测器温度为250 ℃。柱箱升温程序：第1阶段，初始温度150 ℃，保持5 min，以2 ℃/min升温至175 ℃，保持15 min；第2阶段，以6 ℃/min升温至200 ℃，保持20 min；第3阶段，5 ℃/min升温至220 ℃，保持10 min，进样量为1 μL。根据脂肪酸标准品中脂肪酸出峰时间来对样品中各脂肪酸进行定量，每个样品测定3次，取平均值。

牦牛乳中常规营养物质含量采用全自动乳成分分析仪(UV-2550，岛津，日本)测定[16]，瘤胃液pH采用211型精密pH计测定，乳脂中脂肪酸组成测定方法与上述牧草中脂肪酸组成测定方法相同。

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 19.0统计分析软件对数据进行统计分析。对牧草和牦牛乳的营养品质指标，牧草、瘤胃液和乳脂脂肪酸组成以及瘤胃发酵参数进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用LSD法进行多重比较，以P<0.05为差异显著标准。

2 结果与分析

2.1 季节性放牧对牧草营养素含量的影响

由表1可知，春、夏、冬3个季节草地牧草组成相同，均由线叶嵩草、针茅和早熟禾组成。夏季牧草CP含量显著高于冬季、春季牧草(P<0.05)，EE含量显著高于春季牧草(P<0.05)，NDF和ADF含量显著低于冬季、春季牧草(P<0.05)；冬季牧草Ca和P含量显著高于春季、夏季牧草(P<0.05)。

表1 草地牧草组成及其营养素含量

2.2 季节性放牧对牧草脂肪酸组成和含量的影响

由表2可知，放牧季节对牧草中各脂肪酸含量均存在显著影响(P<0.05)。夏季牧草中肉豆蔻酸(C14∶0)、棕榈酸(C16∶0)、c9油酸(c9-C18∶1)、c9t11共轭亚油酸、t10c12共轭亚油酸、总共轭亚油酸、PUFA和饱和脂肪酸(SFA)含量以及PUFA/SFA显著高于春季、冬季牧草(P<0.05)，春季牧草显著高于冬季牧草(P<0.05)；冬季牧草中硬脂酸(C18∶0)含量显著高于春季和夏季牧草(P<0.05)。

表2 季节性放牧对牧草中脂肪酸组成及含量的影响

2.3 季节性放牧对牦牛瘤胃发酵参数、瘤胃液中脂肪酸组成和含量的影响

由表3可知，放牧季节对瘤胃发酵参数、瘤胃液中各脂肪酸含量存在显著影响(P<0.05)。春季、夏季放牧牦牛瘤胃液pH、丙酸和戊酸含量显著高于冬季(P<0.05)；夏季放牧牦牛瘤胃液中乙酸、丁酸、异丁酸、总挥发性脂肪酸、t11油酸(t11-C18∶1)、c9t11共轭亚油酸、t10c12共轭亚油酸、总共轭亚油酸含量显著高于春季、冬季(P<0.05)，春季显著高于冬季(P<0.05)；春季放牧牦牛瘤胃液中异戊酸含量显著高于夏季、冬季(P<0.05)；春季、冬季放牧牦牛瘤胃液中SFA含量和乙酸/丙酸显著高于夏季(P<0.05)，PUFA和PUFA/SFA显著低于夏季(P<0.05)。

2.4 季节性放牧对牦牛乳品质的影响

由表4可知，放牧季节除对放牧牦牛乳中尿素含量和冰点没有显著影响(P>0.05)外，对其他乳品质指标均有显著影响(P<0.05)。春季、夏季放牧牦牛乳中乳蛋白、乳脂、全乳总固体、非脂乳固体、乳糖、酪蛋白含量和酸度显著高于冬季(P<0.05)；春季放牧牦牛乳中游离脂肪酸含量和密度显著高于夏季、冬季(P<0.05)；冬季放牧牦牛乳中柠檬酸含量显著高于春季、夏季(P<0.05)。

表4 季节性放牧对牦牛乳品质的影响

2.5 季节性放牧对牦牛乳脂中脂肪酸含量和组成的影响

由表5可知，放牧季节对牦牛乳脂中各脂肪酸含量均存在显著影响(P<0.05)。春季、夏季放牧牦牛乳脂中辛酸(C8∶0)和葵酸(C10∶0)含量显著高于冬季(P<0.05)；春季放牧牦牛乳脂中月桂酸(C12∶0)、十七烷酸(C17∶0)和硬脂酸含量显著高于夏季(P<0.05)，夏季显著高于冬季(P<0.05)；冬季放牧牦牛乳脂中肉豆蔻酸、十五烷酸(C15∶0)、棕榈酸、花生酸(C20∶0)、棕榈油酸(C16∶1)、亚麻酸(C18∶3)、SFA含量和PUFA/SFA显著高于春季、夏季(P<0.05)；夏季放牧牦牛乳脂中的PUFA如油酸(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)、c9t11共轭亚油酸、t10c12共轭亚油酸、总共轭亚油酸以及PUFA含量显著高于春季、冬季(P<0.05)，春季显著高于冬季(P<0.05)。

表5 季节性放牧对牦牛乳脂中脂肪酸组成和含量的影响

2.6 牧草、牦牛瘤胃液和乳脂中脂肪酸组成的关联分析

由表6可知，牧草-瘤胃液中c9t11共轭亚油酸、t10c12共轭亚油酸、总共轭亚油酸和PUFA含量呈极显著正相关(P<0.01)，和SFA含量呈显著负相关(P<0.05)；牧草-乳脂中c9t11共轭亚油酸、t10c12共轭亚油酸含量和总共轭亚油酸含量呈极显著正相关(P<0.01)，和PUFA含量呈显著正相关(P<0.05)，和SFA含量呈显著负相关(P<0.05)；瘤胃液-乳脂中c9t11共轭亚油酸、t10c12共轭亚油酸、总共轭亚油酸、PUFA含量和SFA含量呈极显著正相关(P<0.01)。

表6 牧草、牦牛瘤胃液和乳脂中脂肪酸组成的关联分析

3 讨 论

3.1 季节性放牧对牧草中脂肪酸组成的影响

脂肪酸在充分氧化作用下可分解为CO2和H2O，并且释放大量能量，因此脂肪酸是机体主要能量来源之一[17]。脂肪酸的来源主要有外源性脂肪酸(大多来自食物)和内源性脂肪酸(由机体通过糖和蛋白质转变而成)，以游离形式存在的自然脂肪酸非常少。根据机体需要可分为非必需脂肪酸(non-essential fatty acid，NEFA)与必需脂肪酸(essential fatty acids，EFA)2类，其中NEFA是指机体可依靠食物营养自行合成的脂肪酸，EFA是指人和动物正常生长所必需的，但机体又不能自行合成，必须依赖食物供应的脂肪酸，如亚油酸、亚麻酸[18]。张晓庆等[19]研究表明，克氏针茅草中亚油酸的含量是38%左右，是以谷物为主要精饲料的饲粮的近20倍，因此放牧家畜体内共轭亚油酸含量更高，其在对不同月份牧草中脂肪酸含量进行测定后发现，内蒙古牧草以8月份最高，9月份次之，7月份最低，并随着时间的变化，棕榈酸、硬脂酸和必需脂肪酸含量呈降低趋势，而亚油酸含量则呈上升趋势，这与本试验所得结果有一定的差别。本试验结果显示，牧草中肉豆蔻酸、棕榈酸、c9油酸、c9t11共轭亚油酸、t10c12共轭亚油酸、总共轭亚油酸、PUFA和SFA含量表现为夏季显著高于春秋和冬季、春季显著高于冬季，硬脂酸含量呈现随季节变化呈现出持续升高的趋势，其中夏季与春节显著高于冬季，出现这种差别可能是采集地、气候环境、温度、牧草种类及采集方法的差异所致，本试验采集地点位于青海省海北州，属于青藏高原，气候存在差异，牧草返青较晚，冬季枯草时间较长，使得测定结果有一定差别。这从侧面说明，不同地域气候条件下，牧草营养素和脂肪酸含量有所不同，因为不同地域由于气候原因，牧草种类及牧草的生长情况均有一定的差异。

3.2 季节性放牧对牦牛瘤胃液中脂肪酸组成的影响

有关放牧牦牛瘤胃液中挥发性脂肪酸含量随季节变化的动态研究较少，本试验通过对春季、夏季及冬季放牧青海大通泌乳牦牛瘤胃液挥发性脂肪酸含量进行测定发现，瘤胃液中乙酸含量最高，在32.15～71.71 mmol/L，其中夏季含量最高，春季最低；瘤胃液中戊酸含量最低，在0.23～0.69 mmol/L；丙酸含量仅次于乙酸，且与乙酸含量的变化趋势相同，夏季高于春季、冬季；丁酸与戊酸含量具有相同的变化趋势，夏季最高，春季次之，冬季最低，这可能是不同的季节气候环境导致牧草中营养素含量不同以及牦牛采食量的不同，使其瘤胃内环境发生改变，导致挥发性脂肪酸含量发生显著改变。有研究发现青绿饲草料发酵后乙酸含量可到70%以上[20]，本试验结果与此基本一致。

本研究中，夏季放牧牦牛瘤胃液中c9t11共轭亚油酸、t10c12共轭亚油酸、总共轭亚油酸、PUFA含量和PUFA/SFA均显著增加，表明瘤胃生物降解不完全。在瘤胃微生物氢化过程中，SFA转化的主要中间体为一系列反式油酸异构体和共轭亚油酸。生物氢化过程中形成的同分异构体分布会影响牛奶中脂肪酸的分布。据Chilliard等[21]报道，给奶牛饲喂青绿饲料较风干饲料会显著提高乳脂中共轭亚油酸的含量；Nielsen等[22]和Kliem等[23]的研究表明，饲喂青绿饲料可以显著提高奶牛乳脂中t10油酸和t11油酸的含量。

3.3 季节性放牧对牦牛乳脂中脂肪酸组成的影响

本研究结果表明，放牧大通泌乳牦牛乳脂中脂肪酸组成和含量易受季节变化的影响，表现为盛草期含量最高，这可能与牧草中脂肪酸组成和含量有关[8]。据报道，易发酵碳水化合物含量高的饲料可增加瘤胃液中总挥发性脂肪酸含量，降低瘤胃液pH，限制脂肪分解，从而限制生物氢化作用[12]，提高牦牛乳脂中PUFA含量[13]。Chilliard等[3]报道了瘤胃中PUFA的生物氢化作用，如亚油酸和α-亚麻酸，当浓缩饲料占饲粮的70%以上时，由于较低的瘤胃液pH限制了亚油酸和α-亚麻酸的生物氢化过程，PUFA含量会降低35%～50%。采用牧草替代浓缩饲料，如饲喂菊苣(CichoriumintybusL.)和车前草(PlantagoasiaticaL.)，不仅可满足家畜的营养需求，同时还改善了牛奶中脂肪酸和PUFA含量。长期以来，放牧一直被认为是高寒草地主要的利用方式，与单一栽培牧草相比，天然牧草可为放牧牦牛提供更为丰富的矿物质营养[24-28]，同时含有瘤胃更容易发酵的碳水化合物(非纤维素碳水化合物)[29]，这可能会在瘤胃发酵期间增加瘤胃液中总挥发性脂肪酸的含量并降低pH，限制脂肪分解，从而限制生物氢化作用[12]，提高牦牛乳脂中脂肪酸和PUFA含量。

3.4 牧草、牦牛瘤胃液和乳脂中脂肪酸组成的关联分析

牧草中的脂肪酸，尤其是PUFA，在反刍动物瘤胃中更容易被生物氢化作用分解，从而造成瘤胃中的脂肪酸，尤其是PUFA含量显著下降，从而降低了它们在乳脂中的含量[7]。本研究中，牧草-瘤胃液-乳脂中c9t11共轭亚油酸、t10c12共轭亚油酸、总共轭亚油酸和PUFA含量两两之间均呈极显著或显著正相关关系，牧草-瘤胃液和牧草-乳脂中SFA含量呈显著负相关关系，瘤胃液-乳脂中SFA含量呈显著正相关关系，这与Toral等[7]的研究结果一致，其认为植物因子可以影响瘤胃的生物氢化过程，通过控制瘤胃中的脂肪酸比例，可控制牛奶中的脂肪酸比例。

4 结 论

季节性放牧对牧草、放牧牦牛瘤胃液和乳脂中脂肪酸含量有显著影响。夏季牧草、放牧牦牛瘤胃液和乳脂中共轭亚油酸和PUFA含量最高，冬季最低。乳脂中共轭亚油酸和PUFA含量与牧草和放牧牦牛瘤胃液中共轭亚油酸和PUFA含量呈显著或极显著正相关。综合分析季节性放牧对牧草、牦牛瘤胃液和乳脂中脂肪酸组成影响的试验结果，建议在夏季进行草地放牧利用，可以获得较高的乳脂共轭亚油酸和PUFA供应量。