60Co-γ辐射诱变在果树育种中的应用与展望*

李 准，伊华林，吴巨勋

（华中农业大学园艺林学学院，园艺植物生物学教育部重点实验室，湖北武汉 430070）

辐射诱变育种是指利用X 射线、γ射线、β射线及中子等物理因素诱导生物体遗传物质发生变异，从中筛选优异突变体，进而育成新品种的育种方法。1896 年Röntgen[1]发现X 射线。1928 年Stadler[2]首次将X 射线应用到玉米和小麦上，成功诱导小麦产生了突变体，开启了辐射诱变的新育种领域。我国植物辐射诱变育种工作起步较晚，开始于20 世纪50 年代，主要研究γ射线和中子，经过长期的基础性研究，辐射诱变育种工作于20 世纪80—90 年代得到快速发展，60Co-γ辐射源在这期间发挥着重要的作用，培育出众多的植物新品种[3-5]。1980 年黄柳根[6]用60Co-γ辐射柑橘品种锦橙接穗，获得早熟、无核少核突变系。1988 年高尔谦等[7]用60Co-γ辐射苹果自然杂交品种国光，培育出抗寒、品质好的新品种宁光。

目前，60Co-γ已成为辐射诱变中最为常用的辐射源[3,4,8]，其在园艺植物育种上的研究应用较多，并在果树育种中取得了明显的效果，但诱变育种方法、遗传机制等缺乏系统性研究。笔者对60Co-γ辐射育种技术在果树育种中的应用情况进行了综述，包括诱变性状类型、辐射剂量、辐射材料类型、诱变育种成果、存在问题和发展趋势等，旨在为未来60Co-γ辐射诱变育种在国内果树中的应用与发展提供启示和借鉴作用。

1 60Co-γ辐射诱变在果树育种中的应用及特点

1.1 诱变性状类型

60Co-γ射线辐射诱变育种中，因不同果树的遗传背景及育种目标不同，在不同果树中获得的变异类型也不同。总体而言，60Co-γ辐射诱导果树获得的有利变异类型主要有无籽或少籽、早熟、短枝及抗性变异等类型。目前通过60Co-γ辐射诱变育种已获得了一批优良的少核无核、短枝、早熟以及抗逆性强的新品种及株系（表1）。此外，在树型、果实色泽、品质和耐贮藏等性状方面也取得了进展。利用60Co-γ射线辐射不同果树，其发生突变的主要方向有所不同。在柑橘中，通过60Co-γ辐射诱变选育的新品种变异性状主要为少核或无核，少数新品种为成熟期及果实大小变异（表1），比如黄建昌等[9-10]利用60Co-γ辐射诱变红江橙和暗柳橙枝条获得了大果无核的优系。在苹果、梨、山楂等落叶果树中，通过60Co-γ辐射诱变选育的新品种变异性状主要是短枝、大果、丰产性等[11-13]，少数是早熟、果皮色泽变异等。赵永波等[11]用60Co-γ辐射诱变向阳红苹果枝条获得了短枝丰产型突变株系；胡钟东等[12]用60Co-γ辐射诱变清香梨的休眠枝，获得了大果型突变株系；阎安泉等[14]用60Co-γ辐射诱变青州敞口山楂的休眠枝获得了早熟、丰产型突变株系。

表1 我国果树运用60Co-γ辐射诱变育种选育的品种（系）

利用60Co-γ射线辐射果树，辐射后的果树因辐射影响往往会造成一定程度的损伤而出现不同类型的易于观察的变异表型，包括叶片不同程度畸形、枝多杈或短粗、丛生、生长量降低等[39]，这类表型能直观地帮助育种人员在育种初期初步筛选可能发生突变的突变体植株。

1.2 诱变材料及剂量选择

提高突变频率在诱变育种中具有十分重要的意义，辐射源、辐射剂量、辐射材料是影响突变频率的重要因素[40-41]，为兼顾突变频率和成活率，通常以半致死剂量作为最适辐射剂量[42]，而不同材料对辐射的敏感度不相同，在果树中，愈伤组织、枝条、种子的敏感度大小依次为愈伤组织＞枝条＞种子（表1）。在60Co-γ辐射育种过程中，柑橘、梨及山楂使用的辐射材料多为枝条，且梨和山楂的辐射剂量小于柑橘（表2）；苹果的辐射材料以自然杂交种子和枝条为主，辐射剂量基本为30～60 Gy。60Co-γ辐射源在苹果、柑橘、梨、山楂等果树中已取得喜人成果，但在桃、李、杏、猕猴桃等果树中并未得到广泛的有效利用，通过60Co-γ辐射诱变选育出的新品种极少或几乎没有，这可能与不同果树对辐射源的适宜度不同相关。如在板栗中，使用的辐射源基本为快中子[43]，在葡萄中多使用He-Ne 激光束及秋水仙素[44]。

其次，在辐射材料上，60Co-γ辐射果树所用的辐射材料以成年态枝条和种子为主（表1）。果树为多年生植物，童期普遍较长，因此以成年态枝条作为辐射材料，辐射剂量基本为20～60 Gy（表2），结合嫁接技术，能有效缩短育种年限。而以种子作为辐射材料所需的育种周期往往较长，因此成年态枝条是60Co-γ辐射诱变在果树育种中应用最为普遍的辐射材料（表1）。

表2 60Co-γ辐射在果树诱变中的参考剂量及诱变后表型

1.3 60Co-γ辐射在果树育种中的成果

据FAO//IAEA 官方网站数据显示，截至2021年7 月，各国通过诱变技术培育果树新品种66 个，其中柑橘15 个、苹果13 个、桃6 个、梨8 个、枇杷1 个、葡萄1 个、樱桃21 个、李1 个；在育成品种较多的柑橘中，用60Co-γ射线育成的品种占53.3%，苹果占76.9%，桃占66.7%，梨占100%，樱桃占38.1%。此外，通过对国内近60 年果树60Co-γ射线诱变育种及其他诱变育种研究情况进行统计分析（图1），国内辐射诱变育种研究开始于20 世纪50 年代，但成功培育出新品种的时间则是在20世纪70 年代，并于20 世纪80—90 年代到达顶峰，这期间培育出的新品种占65.7%，其中通过60Co-γ射线培育出的新品种占81.8%，苹果、柑橘、梨也占主要部分，在这之后的果树新品种数量显著减少，但通过60Co-γ射线诱变获得的新品种依旧占很大一部分，这表明60Co-γ射线在国内果树诱变育种这一领域占据着十分重要的地位。

图1 我国使用60Co-γ辐射及其他诱变方法在果树中获得的品种（系）数量

2 诱变机理研究进展

目前关于60Co-γ辐射诱变机理的研究主要围绕DNA 数量和结构变异及与变异性状相关的基因挖掘，突变的主要原因是碱基增加、缺失、插入及染色体结构和数量的改变等所带来的一系列影响，而具体的诱变作用机理尚不清楚[53]。

针对不同的辐射源，有研究人员提出了不同的学说理论[54]。在60Co-γ辐射诱变育种中，自由基理论认可度较高。自由基理论认为对植株进行60Co-γ照射而导致细胞中出现多种类型的DNA 损伤的现象，是由60Co-γ辐射的直接效应和间接效应所致。用60Co-γ射线辐射生物体，会引起细胞中各种原子和分子发生电离和激发，而当染色体或DNA 发生电离时，其遗传物质将发生不同程度的改变而导致突变。陈荫槐等[55]认为辐射诱变材料时，化学键断裂，产生自由基，自由基与DNA、蛋白质等物质发生反应，是导致辐射材料损伤的重要原因之一。植物细胞中水占主要成分，用60Co-γ射线辐射植株，细胞中的水因吸收大量能量发生射解，形成水自由基，这些自由基不仅可以与细胞中的DNA 等遗传物质发生生物学效应而引起遗传物质发生改变，还可转移到细胞中的蛋白质、酶等生物大分子表面，影响细胞代谢，损害细胞结构。Wijker 等[56]发现60Co-γ辐射使植物DNA 附近形成水自由基，这些水自由基可以诱导DNA 发生碱基替换和碱基移码突变。对用60Co-γ辐照花粉再进行授粉来克服远缘杂交不亲和障碍的这一现象，有研究表明辐射处理改变了植株生殖器官的生理生化性质，包括增强花粉活力、改变细胞膜通透性、激活酶活性[57]等。还有学者提出基因转移学说[58]及配子消失学说[59]对其进行解释，而这些学说需进一步进行验证。

最新研究发现，60Co-γ辐射除了诱发植物传统的DNA 数量和结构的变异，还存在因DNA 甲基化变异而改变的表观遗传控制的性状[60-61]。研究表明，经60Co-γ辐射处理，植株会产生不同程度的DNA 甲基化，进而诱发表观遗传控制的性状发生不同程度的改变[62]，而分析甲基化位点、状态及模式，有助于揭示60Co-γ辐射诱变机理。总体而言，目前国内对60Co-γ辐射诱变机理的研究还不足，在突变体变异的分子机理上的研究较少。

3 60Co-γ辐射诱变育种中存在的问题

3.1 研究应用不平衡，应用范围窄

60Co-γ辐射源是我国运用最早的一种辐射源，用其在果树上进行育种已有一段较长的时间，技术已然成熟，曾培育过众多新品种。但其在20 世纪80—90 年代取得过一段快速发展时期后，在果树上进行60Co-γ辐射诱变育种的发展速度就逐渐放缓。目前果树上的60Co-γ辐射研究在其应用和研究内容上均存在一定的局限性。在应用上，运用60Co-γ辐射诱变育种在果树中培育的新品种集中于苹果、柑橘、梨、山楂等少数果树，在桃、李、枣等果树中只有少量报道[20]，获得的优良经济性状则以少核无核、短枝粗枝为主，很多其他优良的经济性状尚未被挖掘出来；从研究内容上看，国内60Co-γ研究主要还是集中于半致死剂量、辐射材料、诱变效应等方面[63]，在辐射机理研究方面不够深入，将辐射与基因功能研究进行结合的报道较少，对辐射后的变异材料的分子机理研究不足。

3.2 突变体筛选和鉴定不完善

在60Co-γ辐射诱变育种过程中，辐射材料经过辐射诱变后，会产生大量的突变性状，但大多数是属于不利于突变产生的不良性状，只有极少数能产生优异突变。此外，除了早熟、短枝、色泽、抗性等性状便于观察，大量其他不易观察的性状的突变体很难及时在后代群体中发现，一些优良性状的嵌合突变体更是由于自身的不稳定性，很可能在后期消失[64]。如何以简单有效的方法快速筛选鉴定并分离满足要求的优良突变体，是保证育种成功和缩短育种年限的关键[65]。目前诱变育种中常用的鉴定筛选方法有形态学和细胞学观察、生理生化鉴定、分子标记鉴定等，但这些方法各自存在不足之处。形态学观察准确性不足[66]、细胞学观察较为局限、生化分析可能无法检测出部分“隐藏”的基因[17]、分子标记的引物开发和筛选较为困难[67]。不完善的突变体筛选与鉴定方法已成为制约60Co-γ辐射诱变育种在果树中应用的一个关键问题。

3.3 突变性质和方向难掌握

60Co-γ辐射诱变具有偶然性，突变方向具有不确定性，经诱变获得的突变体具有不稳定性，存在盲目性大、预见性差等缺陷。只有增加诱变处理量，选择适宜辐射剂量，提高诱变处理重复率，扩大突变群体，增加选择群体，才能保证获得优异的突变体[68]。宋占菊等[69]用60Co-γ辐射菊花，出现花径缩短、花期推迟的性状，且辐射后同一品种不同单株间存在差异，反映了辐射效应的随机性。为了更为有效地获取符合目标性状的优异突变体，有研究者在辐照处理材料后，通过营造特定环境，定向选择突变体，提高选择效率，该方法能在一定程度上提高突变体选择精准度，但也不能左右突变方向[70]。目前国内60Co-γ辐射方面的研究多注重适宜剂量[71]、诱变效应[72]、诱变手段等研究，针对突变体在生理生化上发生改变的原因探究较少，基础性研究开展不够，要想把握突变方向，需加大辐射诱变的基础性研究工作。

3.4 遗传机理研究缺乏

60Co-γ辐射诱变的遗传机理研究对揭示其诱变本质起着关键作用，掌握其遗传机理为定向诱变育种提供了可能[73]。目前对60Co-γ辐射诱变的遗传机理研究大多还停留在辐射生物效应、细胞及染色体层面的遗传变异，对蛋白、基因水平的研究有待深入。今后对遗传机理的研究应从突变体的分子机理出发，探究DNA、RNA、蛋白之间的联系、结合全基因组测序，从分子水平上揭示其诱变机制及遗传机理，并对各诱变因素的特点加以利用，提高定向诱变的可能性。比如Yan 等[74]利用60Co-γ辐射水稻获得的脆秆突变体对脆秆形成机理进行研究，通过遗传分析和基因定位精细定位发现，该突变体由一个隐形基因控制，在外显子10 和内含子10 的连接处出现7 个碱基的缺失，进而导致阅读框的改变而不能产生功能蛋白。

4 60Co-γ辐射诱变育种的展望

4.1 60Co-γ辐射诱变与传统育种技术及组织培养技术相结合有利于提高育种效率

传统杂交育种利用基因重组进行育种，后代性状具有一定的可预见性；辐射诱变利用基因突变进行育种，基因突变具有偶然性，后代性状预见性差。辐射诱变与杂交育种结合能有效改良后代性状，选育优异的新品种。大田作物在国内产业大，辐射诱变研究应用广泛且深入，杂交育种和辐射诱变结合在大田作物育种中已取得可喜成绩，杨东等[75]通过空间诱变水稻明恢86 干种子，将其与母本台农67进行初次杂交，F2代优良单株再与恢复系N175 杂交，最终选育出福恢673 新品种；郭泰等[76]用优良大豆亲本进行杂交，改良其遗传基础，再通过辐射诱变扩大变异范围，经过定向连续选择，选育出合丰46 号等4 个高油品种（系）。这一系列新品种的选育，表明辐射诱变与杂交育种结合的灵活应用，能更为有效创新种质资源。

此外，辐射诱变与植物组织培养结合是改良植物品种的有效途径之一[77]。辐射诱变与植物组织培养结合能够增加辐射材料类型、扩大辐射范围、拓宽变异谱、提高突变频率、增加选择机会[78]。在辐射诱变中，嵌合体的存在影响着诱变育种进程，通过组织培养能更快地从诱变所产生的突变嵌合体中分离出突变细胞和组织，进而培养成植株，达到快速纯化效果，可缩短诱变育种年限[79]。而辐射植物悬浮细胞和愈伤组织，进行定向筛选也是一种有效获得目标性状突变体的方法，能有效避免嵌合体的产生，获得稳定遗传的变异。张聪等[80]利用60Co-γ辐射甘薯悬浮细胞，经NaCl 抗性筛选，获得3 株耐盐性显著提高的突变体；张学云等[81]利用60Co-γ辐射大叶紫花苜蓿愈伤组织，经NaCl 抗性定向筛选，获得耐盐性高达1.0%的突变株。

4.2 探索新的鉴定技术提高预选效率

优异突变体是60Co-γ辐射诱变育种的目标，而各类突变体需经过详细及大量的筛选与鉴定才能确定其特点及变异位点，过程繁琐，工作量大。且经辐射诱发的突变体多以嵌合体的形式存在，这又进一步加大了优异突变体的选择难度，如不及时将其分离，突变体细胞很容易被正常细胞掩盖[82]。因此辐射材料后的早期预选在60Co-γ辐射诱变育种中占有重要地位。常用的早期筛选方法为形态学鉴定，但该方法易受环境和人为因素影响，因此准确性较差，需与生化鉴定和分子标记结合使用[83]。目前，缺乏准确的能高通量筛选鉴定突变体的方法。建立高通量的植物表型平台，增加植物各生育时期形态学性状鉴定的准确性，实现对高效光合、抗旱等性状的准确、高效、高通量的预选，是今后提高辐射育种预选效率的一个有效研究方向。其次，针对某些特定性状的育种需求，采用单一因素或多因素结合进行预选，能有效减少育种工作量，目前这一方法已在抗旱、抗盐碱等性状上成熟运用，在其他性状上的应用有待进一步研究。

4.3 60Co-γ辐射诱变与功能基因组学结合提高分子机制研究效率

辐射诱变通过辐射诱导植物，改变其碱基序列，使植物基因发生突变。目前人类已经能有效地对植物基因组进行测序，已有近200 种植物完成了全基因组测序[84]。对已完成全基因组测序的物种，通过对变异植株进行重测序，分析突变体变异位点相关信息，鉴定和定位变异基因并解析其功能，能更有效地对植物性状形成机理进行研究；而针对未完成基因组测序的物种，也能通过分子标记对变异位点进行定位分析，利用图位克隆技术进行基因定位。通过60Co-γ辐射获得的性状变异植株可作为功能基因组学的重要材料[85]。Zheng 等[86]用60Co-γ射线辐照日本裸水稻后所产生的6 个突变体和3 株对照进行全基因组测序，通过生物信息学工具进行分析，对叶绿体和线粒体基因组中的单碱基突变进行了鉴定和深入分析，从基因组水平上揭示了60Co-γ射线诱发水稻细胞质突变的特征；Kim 等[87]利用RNA 测序一个经辐射诱变显示黄花的兰花突变体，对野生型和突变型间的差异表达基因进行分析，同时利用实时定量分析方法分析叶绿素代谢和离子转运，表明叶绿素代谢和离子转运的改变可能是兰花叶片颜色发生变化的原因之一。

目前，园艺植物中仍有大量基因的功能尚不清楚，以60Co-γ辐射产生的优异性状突变体为材料，能有效推动功能基因组学研究，而优异性状突变体的生理生化及其潜藏其背后的分子机制的研究将逐步加强，为辐射诱变夯实理论基础。随着60Co-γ辐射诱变与定向筛选结合趋势的加快，相信辐射诱变技术将会成为为果树功能基因组学研究提供更加丰富材料的有效手段。