基于壳聚糖的复配天然保鲜剂对鲜切莲藕的冷藏保鲜效果

刘晓珊，来 昊，严兆兰，张 岩，冯艳丽，余 翔

(1.食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室，湖北 黄石 435002；2.湖北师范大学 生命科学学院，湖北 黄石 435002)

0 引言

随着社会发展与生活节奏的加快，消费者对新鲜、营养、方便且安全的鲜切净菜产品日益关注[1]，莲藕[2]、菠萝[3]、西瓜[4]和桃子[5]等众多果蔬被开发成鲜切蔬菜产品来满足消费者的需求，其中鲜切莲藕制品以其处理方便、营养丰富和口感脆嫩等优点而深受消费者的喜爱。由于新鲜莲藕原料内富含水分和酚类物质[6]，在切分处理以及后续低温贮藏过程中，极易由于机械损伤造成鲜切莲藕制品表面脱水萎缩、褐变，甚至发生腐败变质的现象，从而影响鲜切莲藕产品感官和安全品质，缩短其货架期，极大地制约了鲜切莲藕产业的发展，因此如何延长鲜切莲藕制品保鲜期成为产业发展中亟待解决的问题，众多研究人员开展了系列研究，出天然保鲜剂保鲜法[7]、化学保鲜剂保鲜法[8]和气调保鲜法[9]等技术，取得了较好的保鲜效果。其中，天然保鲜剂以其成本低廉，操作简单和安全高效等优点受到研究者的广泛关注，众多安全、高效的天然保鲜物质，例如壳聚糖、迷迭香提取物、乳酸链球菌素(Nisin)、茶多酚等被开发出来应用于果蔬制品保鲜加工中，取得了较好的应用效果。但研究同时也表明，使用单一天然保鲜剂其保鲜效果有限，往往会出现保鲜剂用量大但保鲜效果有限的现象，其抑菌性、抗氧化能力和膜的理化性能较差[10]。根据栅栏技术的原理，将具有不同保鲜功效的天然保鲜剂组分进行复配，可发挥各种天然保鲜剂组分的协调效应，使保鲜效果大幅提升[7]，是未来天然保鲜剂开发的方向。

课题组前期通过单因素和正交试验优化出一种基于壳聚糖的复配天然保鲜剂(壳聚糖15 g/L、迷迭香提取物1.5 g/L、Nisin 2.25 g/L)，应用于鲜切莲藕保鲜可以大幅提升鲜切莲藕的冷藏货架期。

为尽快将该复配天然保鲜剂应用于规模化生产，本试验对采用该复配天然保鲜剂处理的鲜切莲藕在冷藏过程中的感官、色泽、失重率、维生素C含量、可溶性固形物(Total soluble solid, TSS)、多酚氧化酶活性(Polyphenol oxidase, PPO)、过氧化物酶活性(Peroxidase, POD)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量和菌落总数等指标进行跟踪监测，全面评价该复配天然保鲜剂对鲜切莲藕冷藏保鲜效果的影响，为后续鲜切莲藕规模化保鲜生产提供理论参数和实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜莲藕(鄂莲3号)，购于黄石市沈家营采阳园农贸市场。

壳聚糖(脱乙酰度≥90%)，迷迭香提取物(水溶性)和乳酸链球菌素，均为食品级，河南圣斯得实业有限公司。

苯酚、3，5-二硝基水杨酸、愈创木酚、硼酸、氧化酶、硫酸、氢氧化钠等，均为分析级，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV1900紫外可见分光光度计，日本岛津公司；5418R台式高速冷冻离心机，德国艾本德公司；CR-10型色差计，日本柯尼卡美能达公司；CP114型电子天平，美国奥豪斯仪器(上海)有限公司；YT-4型手持折光仪，上海实验仪器总厂。

1.3 实验方法

1.3.1 复配天然保鲜剂配制及样品处理方法 基于壳聚糖的复配天然保鲜剂参照前期研究获得的配方(壳聚糖15 g/L、迷迭香提取物1.5 g/L、Nisin 2.25 g/L)进行配制，简称CRN(Chitosan + Rosemary extract + Nisin)保鲜剂。具体步骤为：称取相应重量的壳聚糖用1%醋酸溶液溶解制成壳聚糖溶液，再根据比例称取相应重量的迷迭香提取物和Nisin溶解至壳聚糖溶液中，搅拌均匀制成复配天然保鲜剂，4℃贮藏备用。

1.3.2 样品处理 对照组(Control组)：挑选成熟度一致、肉质白、无病虫害和机械损伤的莲藕，洗净后切成3 mm厚的薄片，从中挑选大小均一的莲藕切片30片，逐片称重后编号，用小号保鲜袋分装，置于4℃贮藏备用。实验组(CRN处理组)：取30片大小均一的莲藕切片，置于复配保鲜剂溶液中浸泡10 min，料液比为1∶2(g/mL)。捞出置于4℃沥干20 min，逐片称重编号，用小号保鲜袋分装，4℃冷藏备用。

在鲜切莲藕冷藏过程中，从新鲜原料开始，每隔2 d各从对照组和实验组中随机取3片鲜切莲藕样品，拍照后进行相关指标测定，一共测定12 d.

1.3.3 测定指标与方法

1)色度

采用色差计在所选的鲜切莲藕样品上均匀选取3个点进行色度测定，结果以a*，b*和L*值表示。

2)失重率

采用称重法测定失重率，结果以%表示，计算公式如下：

3)可溶性固形物含量(Total soluble solid, TSS)

采用手持折光仪分别测定鲜切莲藕的TSS，结果以%表示[11]。

4)维生素C含量

维生素C含量测定参照Yaman等[12]的2，6-二氯酚靛酚盐滴定法进行测定，结果以mg/100g表示。

5)多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性测定

参照Gao等[13]的方法进行粗酶液制备，稍作修改。取2 g鲜切莲藕样品组织加入8 mL预冷至4℃的磷酸钠缓冲液(50 mmol/L, pH 6.8)(含2%聚乙烯吡咯烷酮)，匀浆后4℃，12 000×g离心15 min，取上清即为粗酶液。

PPO测定时，将2.8 mL的邻苯二酚溶液(9 mM)和0.2 mL粗酶液混合，迅速置于420 nm下测定其吸光度。酶活以样品鲜重为基础表示为Ug-1, U=0.01△A420nm min-1.

POD测定时，取0.1 mL粗酶液，2.4 mL磷酸钠缓冲液(50 mmol/L，pH 6.8)和0.25 mL愈创木酚溶液(0.16 mol/L)进行混合后加入0.25 mL H2O2溶液(0.88 mol/L)，迅速置于470 nm下测定其吸光度。酶活以样品鲜重为基础表示为Ug-1, U=0.01△A470nm min-1.

6)MDA含量的测定

根据Gao等[13]方法，稍作修改。取2 g莲藕组织加入4 mL含0.5%(w/v)硫代巴比妥酸的10%(w/v)三氯乙酸溶液进行匀浆，然后将匀浆混合物在100℃加热10 min后迅速冷却，然后置于5 000×g离心15 min，取上清液在450 nm, 532 nm和600 nm下测定吸光度。MDA浓度以样品鲜重为基础表示为μmol g-1.

7)菌落总数的测定

参照GB4789.2—2016规定的方法《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》对样品进行测定。

1.4 数据处理

试验数据采用SPSS 18.0统计软件的one-way ANOVA程序进行数据分析，结果以平均值±标准偏差来表示，P<0.05为差异显著性标准。

2 结果与分析

2.1 CRN保鲜剂对鲜切莲藕外观和色差的影响

图1为对照组和CRN保鲜组鲜切莲藕样品4 ℃贮藏12 d的感官情况，对照组鲜切莲藕样品从贮藏第2 d开始，表面颜色变红而且随着贮藏时间的延长，颜色逐步加深。贮藏至第6 d，对照组鲜切莲藕样品表面开始出现明显的脱水萎缩现象并随着贮藏的时间延续不断加重。CRN保鲜剂处理组鲜切莲藕样品在整个贮藏过程中，色泽鲜亮，无明显脱水萎缩现象，保鲜品质较好。

图1 CRN保鲜剂处理对4℃贮藏的鲜切莲藕感官品质的影响

采用色差仪进行的色差检测能够将低温贮藏过程中鲜切莲藕产品表面的褐变进程以a*，b*和L*值来定量表示，是客观评价鲜切莲藕品质的重要指标。两组鲜切莲藕样品4℃贮藏过程中的色差变化如图2 a)b)c)，在整个12 d的低温贮藏过程中，对照组和CRN处理组鲜切莲藕样品的红度值(a*)和黄度值(b*)值均呈上升趋势，但CRN处理组的上升幅度明显低于对照组(P<0.05)。亮度(L*)值在整个贮藏过程中均呈下降趋势，CRN处理组的下降幅度显著低于对照组(P<0.05)。色差值的变化与感官结果相符，据此分析，可能是由于CRN保鲜剂中的壳聚糖成分在鲜切莲藕表面形成了致密的可食性膜，隔绝了鲜切莲藕与空气的接触，再加之CRN保鲜剂内迷迭香提取物组分的高效抗氧化能力，延缓了CRN处理组鲜切莲藕样品的酶促褐变进程。张春洁[14]、李丽[15]和阚超楠等[16]的研究均表明，壳聚糖处理对鲜切蔬菜制品(莲藕、梨)均有较好的防褐变效果，本研究与之相符。

图2 CRN保鲜剂处理对4℃贮藏的鲜切莲藕色差a)a*值，b)b*值，c)L*值的影响

2.2 CRN保鲜剂对鲜切莲藕失重率的影响

鲜切莲藕在加工过程中由于失去表皮的保护，加之切分处理导致的机械损失加剧鲜切莲藕的呼吸作用，导致其在冷藏过程中出现大量的水分蒸发使得失重率增大，导致莲藕组织萎缩和鲜脆的口感丧失，极大地影响其外观和口感，因此，如何降低鲜切莲藕的失重率是保鲜的关键。采用CRN保鲜剂处理的鲜切莲藕样品4 ℃冷藏过程中失重率变化如图3，对照组鲜切莲藕样品从贮藏第2 d开始，其失重率呈大幅上升趋势(P<0.05)，而CRN处理组鲜切莲藕在整个贮藏期间上升幅度较小，贮藏12 d后失重率仅为4.11%，失重率变化不显著(P>0.05)，与“2.1 CRN保鲜剂对鲜切莲藕外观影响”的结果一致。分析原因，可能主要是由于壳聚糖在表面形成的致密可食性膜减少了水分的蒸腾作用，降低了水分散失，进而使鲜切莲藕的失重率下降。陈花[17]和Meng X H等[18]的研究结果也证实，果蔬采后经壳聚糖涂膜后，在表面形成的可食性膜能降低水分的蒸发，同时阻隔外界O2的进入，使得果蔬表面形成高CO2低O2的气体环境减弱果蔬的呼吸作用，有助于减缓果蔬贮藏过程失重率的升高和有机物质的分解。

图3 CRN保鲜剂处理对4℃贮藏的鲜切莲藕失重率的影响

2.3 CRN保鲜剂对鲜切莲藕TSS含量的影响

TSS含量指果蔬内可溶性糖类(单糖、双糖和少量多糖)、维生素和有机酸等小分子物质的总量，直接反映果蔬营养品质，也是评价其保鲜效果的重要指标[19]。CRN保鲜剂处理鲜切莲藕冷藏过程中TSS变化如图4.两组鲜切莲藕样品TSS含量均呈先缓慢下降后急剧升高再缓慢下降的趋势。在贮藏前4 d，对照组鲜切莲藕样品的下降幅度略高于CRN处理组(P>0.05)，可能是由于鲜切莲藕的呼吸作用会消耗莲藕组织内存在的可溶性糖，导致TSS含量下降，CRN保鲜剂处理后的鲜切莲藕样品呼吸强度受到一定的抑制，因此其下降幅度略低于对照组。在贮藏4 d～8 d过程中，两组鲜切莲藕样品内TSS含量均急剧上升，CRN处理组上升幅度及含量均显著高于对照组(P<0.05)，分析原因可能是此阶段由于鲜切莲藕内可溶性糖被消耗殆尽，为了维持正常的呼吸代谢，大量的淀粉类多糖被水解为可溶性糖，导致鲜切莲藕TSS含量快速上升，而CRN保鲜剂处理组样品的呼吸作用受到抑制，其可溶性糖的损耗速度大幅低于对照组，使得TSS大量积累。贮藏8 d以后，由于鲜切莲藕呼吸强度的上升和微生物大幅增殖引起鲜切莲藕发生腐败，鲜切莲藕组织内可溶性糖的消耗速度高于淀粉类多糖的分解速度，导致TSS含量开始下降，冷藏至12 d，CRN处理组TSS含量(8.23%)显著高于对照组TSS含量(6.76%)(P<0.05)。本研究与唐倩等[20]采用电解臭氧水对鲜切莲藕进行保鲜的研究结果一致。由此说明，CRN保鲜剂处理能一定程度抑制鲜切莲藕的代谢，减少TSS的降低和质量损失。

图4 CRN保鲜剂处理对4℃贮藏的鲜切莲藕维生素可溶性固形物含量的影响

2.4 CRN保鲜剂对鲜切莲藕维生素C含量的影响

维生素C又称抗坏血酸，具有提高免疫力、抗衰老、促进伤口愈合和维持骨骼正常功能等功效，是人体生长发育过程中必不可少的一种营养元素，果蔬类食品是人体维生素C摄入的主要来源。大量研究已证实维生素C在常态下不稳定，在果蔬加工及贮藏过程中极易由于自身氧化而发生降解。因此，如何降低果蔬保鲜过程中维生素C的损耗是其保鲜工艺所关注的重要方面。CRN保鲜剂处理对鲜切莲藕样品4℃贮藏过程中维生素C含量的影响见图5.两组鲜切莲藕样品在冷藏过程中均呈下降趋势，但CRN保鲜剂处理组的下降速度低于对照组，第4 d以后，CRN处理组鲜切莲藕维生素C的含量显著高于对照组(P<0.05)，尤其是在第8 d，CRN组鲜切莲藕的维生素C含量为21.86 mg/100 g，对照组仅为13.04 mg/100 g，达到最大差值，继续冷藏至12 d，CRN组鲜切莲藕的维生素C含量下降至13.86 mg/100 g，但依然显著高于对照组(6.24 mg/100 g)(P<0.05)。说明CRN保鲜剂处理能够降低维生素C的降解从而维持鲜切莲藕良好的营养品质，其原因可能是由于CRN在鲜切莲藕表面形成的可食性膜隔绝其与外界的O2接触，在膜内形成低O2环境，再加之可食性膜中的迷迭香提取物组分具有较好的抗氧化能力，协调抑制了维生素C的氧化分解。在蓝莓[21]和鲜切苹果[22]的保鲜研究中发现，基于壳聚糖的复配天然保鲜剂涂膜处理能够显著抑制果实维生素C的下降，本研究结果与之相符。

图5 CRN保鲜剂处理对4℃贮藏的鲜切莲藕维生素C含量的影响

2.5 CRN保鲜剂对鲜切莲藕PPO和POD活性的影响

果蔬贮藏过程中，PPO能将组织内的酚类物质氧化为不稳定的醌，醌进一步聚合生产黑色物质引起果蔬褐变。POD作为一类氧化酶，能将果蔬代谢中产生的H2O2分解为H2O和O2，同时能促进酚类物质形成醌，与PPO协同作用促进果蔬褐变[23,24]。因此，控制PPO和POD酶活性是延缓果蔬贮藏过程中酶促褐变速度，提高保鲜效果的关键点。CRN处理对鲜切莲藕样品4℃贮藏过程中PPO和POD活性的影响见图6和图7.对照组PPO活性从贮藏第2 d开始大幅上升，在第6 d达到最高(60.79 Ug-1)，随后开始小幅下降，这可能跟鲜切莲藕样品贮藏过程中组织内的酚类物质被消耗导致总量下降有关，而CRN保鲜剂处理组在整个冷藏过程中呈略微升高趋势(P>0.05)，贮藏至第12 d，其PPO活性(17.95 Ug-1)仍显著低于对照组(P<0.05)。两组鲜切莲藕贮藏过程中的POD活性变化与PPO活性的变化一致(图7)，CRN处理组鲜切莲藕样品在整个12 d贮藏过程中POD活性变化不明显，贮藏至第12 d其POD活性为17.32 Ug-1.但相比于对照组，贮藏过程中CRN处理组POD活性显著低于对照组(P<0.05)。相关研究表明，采用基于植物多糖(壳聚糖[25]、海藻酸钠[14]、山药黏液[26]等)的复配天然保鲜剂对鲜切果蔬进行保鲜处理，能有效降低鲜切果蔬PPO和POD活性，达到延缓鲜切果蔬褐变提高其保鲜效果的目的。本研究结果与之相符，确定CRN保鲜剂能够抑制鲜切莲藕PPO和POD活性的增长，延缓鲜切莲藕褐变。

图6 CRN保鲜剂处理对4℃贮藏的鲜切藕片PPO活性的影响

图7 CRN保鲜剂处理对4℃贮藏的鲜切藕片POD活性的影响

2.6 CRN保鲜剂对鲜切莲藕MDA含量的影响

鲜切果蔬在切分处理中容易导致组织损伤，其创面组织在氧自由基(reactive oxygen species, ROS)和脂肪氧合酶(lipoxygenase, LOX)的作用下导致细胞膜中的多不饱和脂肪酸组分被加速氧化成脂质氢过氧化物，使得创面细胞膜进一步发生过度氧化损伤，容易造成鲜切果蔬切分处发生快速褐变现象[27]。MDA是植物组织细胞发生膜脂过氧化的主要产物。通过 MDA的含量可以评价植物组织细胞膜系统的损伤程度和衰老程度[28]。在本研究中，CRN保鲜剂对鲜切莲藕MDA含量的影响见图8，对照组鲜切莲藕在贮藏过程中MDA含量显著上升(P<0.05)，而CRN处理组鲜切莲藕MDA含量上升速度较慢，贮藏第12 d 其MDA含量为2.26 μmol·g-1，显著低于对照组MDA含量(4.31 μmol·g-1)(P<0.05)，说明CRN涂膜保鲜处理后的鲜切莲藕细胞膜过度氧化程度被降低，有延缓鲜切莲藕的褐变速度的效果，这与杨丽嫔等[26]对鲜切马铃薯保鲜的研究结果一致。

图8 CRN保鲜剂处理对4℃贮藏的鲜切莲藕MDA含量的影响

2.7 CRN保鲜剂对鲜切莲藕菌落总数的影响

鲜切果蔬在切分过程中的机械损伤容易造成组织内汁液等营养成分外流，为微生物增殖提供了营养供给和生长环境，是加速鲜切果蔬产品发生腐败变质的主要原因[29]，因此，如何抑制鲜切果蔬产品冷藏过程中的菌落总数增长是其保鲜工艺的关键控制点。CRN保鲜剂对鲜切莲藕菌落总数的影响见图9.随着冷藏时间的延续，对照组和CRN保鲜组鲜切莲藕的菌落总数均呈上升趋势，贮藏至第12 d, CRN处理组菌落总数为5.01 lgCFU g-1，且CRN保鲜组始终显著低于对照组(P<0.05)。分析原因可能是由于鲜切莲藕经CRN保鲜剂处理，保鲜剂中的Nisin组分能够有效地抑制微生物的增殖，再加之壳聚糖良好的成膜性能在鲜切莲藕表面形成致密的可食性膜最大化地阻隔了鲜切莲藕与O2的接触，抑制了好氧微生物的生长。王发祥[30]和夏天龙等[31]的研究也表明,低温下鲜切莲藕表面微生物主要以假单胞菌属、欧文氏菌属、肠杆菌属、乳酸菌属和霉菌等好氧或兼性好氧微生物为主。据此确定本研究采用的CRN保鲜剂对鲜切莲藕具有较好的抑菌效果，能较好地延缓冷藏过程中鲜切莲藕的腐败变质速度。

图9 CRN保鲜剂处理对4℃贮藏的鲜切莲藕菌落总数的影响

3 结论

采用基于壳聚糖的复配天然保鲜剂(壳聚糖15 g/L、迷迭香提取物1.5 g/L、Nisin 2.25 g/L)处理的鲜切莲藕在4℃冷藏过程中，鲜切莲藕的感官品质和色泽良好，失重率、PPO、POD活性、MDA含量和菌落总数均大幅低于对照组，而维生素C和TSS等营养物质含量高于对照组，说明CRN保鲜剂能够有效抑制鲜切莲藕冷藏过程中组织脱水、酶促褐变和微生物的增殖，并延缓维生素C和TSS等营养物质的损耗，保鲜效果十分明显。本研究在证明该基于壳聚糖的复配天然保鲜剂合理性和科学性的同时，也为其它基于壳聚糖涂膜的鲜切果蔬复配天然保鲜剂开发提供研究思路和借鉴。