复方牙痛酊对牙周炎模型大鼠的保护作用

罗诗豪，周志军，胡静，曾宪晶

井冈山大学附属医院，江西 吉安 343000

牙周炎是由多种因素引起的牙周组织的慢性感染，以牙龈炎症和牙槽骨破坏为主要表现，严重者可导致牙齿松动，甚至脱落。作为成年人失牙最主要的病因，一项调查报告指出：牙周炎在世界范围内高发，涉及各个年龄段，患者人口占比高达全球人口的10%［1］。当前牙周炎以牙周基础治疗为主，配合局部或全身药物治疗。近年来研究发现，基质金属蛋白酶（MMPs）基因的功能多态性与牙周炎风险性的增加密切相关，在骨破坏及重塑中发挥重要作用［2］。炎性因子水平与牙周炎严重程度成正比,可用于预测慢性牙周炎的预后［3］。研究表明［3-4］：一些中药及其提纯的有效成分可通过抑制MMPs 活性，减轻炎性反应而起到治疗牙周炎的作用。本实验以MMPs 相关蛋白及炎性因子为研究切入点，探讨复方牙痛酊对实验性牙周炎大鼠的影响，为临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验试剂与仪器

牙龈卟啉单胞菌（北京北纳生物技术研究院）；脂多糖溶液（武汉博士德生物科技有限公司，2021A125）；盐酸米诺环素溶液（上海美优制药厂，H10950348）；复方牙痛酊（贵州同济堂制药公司，Z20025807）；水合氯醛（中国医药集团有限公司，20201206）；ELISA 检测试剂盒（北京伊塔生物科技有限公司）；RIPA 裂解液（武汉博士德生物科技有限公司）；酶标仪（TC1000-S，美国赛默飞）；体视显微镜（苏州南光光学仪器公司）；移液器（德国eppendorf 公司），SD 大鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司）。

1.2 动物造模与分组

将35 只健康成年SPF 级SD 大鼠，体质量（250±50）g，鼠龄范围10～12 周，雄雌比为18∶17，实验单位使用许可证编号为SYXK（赣）2012-0001，生产许可证号SCXK（湘）2016-0002，动物房内适应性喂养1 周后转入实验造模，本实验通过动物伦理审查。将大鼠分为造模组（30 只）和空白组（5 只），其中空白组正常喂养，未行任何处理。造模组大鼠通过磨牙结扎和牙龈卟啉单胞菌感染诱导牙周炎，采用文献［5-6］记录的操作方法对大鼠进行造模：用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取4-0 丝线结扎双侧上颌第1 磨牙的颈部区域，之后用移液器每隔2 天将含2 μL 牙龈卟啉单胞菌和15 μL 脂多糖溶液的生理盐水均匀注入到大鼠龈沟内丝线处，连续造模4 周，每日观察牙龈情况。大鼠造模成功标准参考文献［7］记录方法：大鼠牙龈组织内可见炎性细胞浸润，结缔组织中胶原纤维破坏，结合上皮向根部增生，牙周袋加深；牙槽骨结构疏松，骨吸收陷窝形成，破骨细胞数量明显增多。

本次实验共筛选出符合模型要求大鼠24 只。将造模后的大鼠染色标号，采用随机数字表法分3 组：模型组、对照组、实验组，每组各8 只。给药方法：模型组灌胃等量的生理盐水，对照组按45 mg/kg 灌服等量的盐酸米诺环素溶液，实验组按500 mg/kg 灌胃复方牙痛酊（贵州同济堂制药公司，国药准字Z20025807，规格：50 mL/瓶），给药剂量参照人与动物体表面积折算的等效剂量系数折算法［8］。每日给药2 次，连续灌胃给药4 周，直至取样节点。

1.3 检测方法

（1）ELISA 法检测血清MMPs 及炎性因子水平，各组大鼠尾静脉采集血液样本，采用蛋白裂解液提取总蛋白，置入酶标板孔中，滴入生物素标记抗体，加入ABC 工作液，TMB 显色，酶标仪在波长450 nm 测定各孔的OD 值，绘制标准曲线。（2）大鼠牙槽骨吸收测定，大鼠麻醉后处死，逐步分离上颌骨组织，接着放入亚甲蓝染液中染色2 min，用体视显微镜观察上颌骨形态变化，测量第一至第三磨牙处釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离，把其平均值作为该牙牙槽骨吸收值。（3）荧光染色：首先配制胶原纤维染色苦味酸天狼猩红染液，切片脱蜡，乙醇梯度脱水，漂洗，苦味酸天狼猩红染液染色后漂洗，脱水，透明，封固，偏振光荧光显微镜下观察切片。（4）HE 染色：切片制作与染色，收集各大鼠上颌第1 磨牙的牙龈组织，置于4%多聚甲醛的BS 中固定，常规脱钙，接着脱水透明，浸蜡包埋，制作切片，常规HE 染色后，使用电子显微镜在10×20的视野下观察细胞形态病理变化。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠造模后体质量比较

造模前，各组大鼠的体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。造模4 周后空白组大鼠体质量为（274.1±24.1）g，造模组体质量为（269.9±23.7）g，两组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 大鼠造模前后牙龈对比

图1 为实验性牙周炎大鼠造模前后对比图，其中图1A 造模前大鼠牙龈未见明显红肿；图1B 造模成功后大鼠牙龈可见明显红肿，并出现较深的牙周袋，食物残渣堆积；图1C 造模前大鼠牙周组织胶原纤维分布均匀、致密、方向较一致，边界较完整；图1D 造模成功后大鼠胶原纤分布不均匀、疏松，排列紊乱，并可见黑色吸收空洞；图1E 造模前大鼠牙龈上皮结构完整，结合上皮、沟内上皮结构正常；图1F 造模后牙周组织中炎症破坏明显，结合上皮向根部增生。

图1 实验性牙周炎大鼠造模前后对比图

2.3 各组大鼠牙槽骨吸收测定

空白组釉牙骨质界到牙槽靖顶之间的距离未见异常，与空白组相比，模型组、对照组、实验组大鼠釉牙骨质界到牙槽嵴顶距离显著增加（P＜0.05）；与模型组相比，对照组、实验组大鼠釉牙骨质界到牙槽嵴顶距离减少（P＜0.05）；与对照组比较，实验组大鼠釉牙骨质界到牙槽嵴顶距离减少（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠釉牙骨质界到牙槽嵴顶距离（mm，）

表1 各组大鼠釉牙骨质界到牙槽嵴顶距离（mm，）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与对照组比较，cP＜0.05。

2.4 各组大鼠血清MMPs 及炎性因子水平结果

与空白组相比，模型组大鼠血清MMPs 及炎性因子（TNF-α，IL-6，IL-8）明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，对照组、实验组血清MMPs 及炎性因子降低（P＜0.05）；与对照组比较，实验组大鼠血清MMPs 及炎性因子降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清MMPs及炎性因子水平结果（ng/mL，）

表2 各组大鼠血清MMPs及炎性因子水平结果（ng/mL，）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与对照组比较，cP＜0.05。

2.5 HE 染色结果

空白组牙龈组织中细胞形态正常、结构完整，可见复层鳞状上皮细胞，牙周膜内胶原纤维形态结构规整，排列有序，见图2A。模型组牙龈组织中细胞结构破坏，排列不齐，牙周膜内胶原纤维变性、破坏，伴大量炎性细胞浸润分布，并有微小脓肿形成，骨内见大量的破骨细胞，深牙周袋形成，见图2B。对照组（图2C）及实验组（图2D）均可见细胞结构稍完整，排列较齐，胶原纤维结构破坏减轻，仍伴炎性细胞浸润，破骨细胞数目减少；较对照组而言，实验组整体病理损伤减轻。

图2 各组大鼠牙龈组织HE染色结果（×200）：A为空白组；B为模型组；C为对照组；D为实验组

3 讨论

目前关于牙周病的病因和发病机制尚未完全阐明，研究显示MMPs 及免疫炎性反应与牙周病的发病密切相关，MMPs 被认为是牙周炎过程的重要调控因子，介导炎症反应过程［9］。MMPs 共有28 个成员，作为锌和钙依赖性细胞外蛋白水解酶中的一种分泌酶，能够降解大部分细胞外基质［7］。MMPs通常分成五类不同的酶（明胶酶、胶原酶、膜型MMPs、基质蛋白酶、其他蛋白酶），研究已经证明［10］在牙本质中含有明胶酶（MMP-2、MMP-9），它们由成牙本质细胞产生并分泌到细胞外基质中，不仅参与牙胚时期牙本质有机质形成和矿化的调控，还参与牙齿增龄性变化、牙本质修复等生理过程，并参与了某些病理过程如龋病、牙周病等的发展过程［11］。MMPs 不仅在健康牙本质有特异性表达，在龋坏的牙本质中也呈现出不同的表达状态，甚至表现出更高的活性［12］。本实验结果模型组MMPs 表达明显升高，印证了上述结论。MMPs与牙周病损伤密切相关。究其作用途径，其一是细菌产酸使口腔内环境pH 值降低，继而激活MMP-2和MMP-9。当pH 值为4.5 时，其活性可提高4 倍，在一定范围内，其分解胶原蛋白的能力与pH 值成正比，龋坏牙齿暴露于口腔中时，唾液的缓冲作用使得MMPs 处于接近中性的环境中，MMPs 才能较大程度地促进龋病发展［13］。其二，口腔中含有胶原结合黏附素的变异链球菌能够直接激活MMP-9，导致牙周损伤。同时，牙周局部炎症会破坏上皮的完整性，使牙周袋内的炎症递质如白细胞介素等细胞因子从牙周袋进入血液循环系统和外周免疫器官，引起系统性炎症反应［14］。TNF 是牙周组织破坏中重要的致炎细胞因子，从牙周炎微环境炎性细胞的迁移到组织的破坏它都参与，刺激参与趋化因子细胞迁移到感染和炎症部位增强免疫反应，通过上调IL-1β 和IL-6 的表达促进MMPs 的表达，从而增加破骨细胞活性和降低成骨细胞活性导致牙周炎组织破坏［15-16］。IL-6 是病原体刺激促炎细胞因子诱导炎症反应的放大因子，能够促进淋巴B 细胞分化和促进炎症的发生，在免疫反应中起到促炎作用［17］。IL-8 通过激活中性粒细胞，释放一系列的活性产物，最终导致机体局部的炎症反应［18］。本实验在切片上观察模型组损伤最明显，实验组和对照组均可抑制造模剂所致的牙龈损伤，且实验组在减轻大鼠牙龈症状方面优于对照组，MMPs 和炎性因子水平更低，提示复方牙痛酊通过抑制MMPs 和炎性因子释放而发挥作用。

盐酸米诺环素具有高效抗菌作用，且易渗透，在临床上常采用米诺环素治疗牙龈炎，该药属于四环素衍生物类抗生素，具有强效抑菌作用，且药效持久，对革兰阴性菌、放线菌等多类病原菌具有良好抑制作用，还可干扰胶原酶活性，降低牙龈组织破坏程度［19］。牙周病属中医“牙宣、齿槁”等病范畴，最早在《黄帝内经》中记载:“足少阴气绝则骨枯……肉软却故齿长而垢”，描述了牙周炎牙龈萎缩、牙根外露、牙垢附着等表现。究其病因，或饮食偏嗜，或酒烟不节，劳伤脾胃，致内湿蓄积，阻滞气机，渐至壅盛，蓄久化热，湿热上蕴口窍致牙周炎，其治疗方法当以祛风除湿、泄热解毒、散瘀止痛为主［4］。复方牙痛酊中宽叶缬草祛风除湿，行气活血止痛；凤仙花祛风通络、清热解毒，活血止痛；红花活血散瘀止痛；樟木清热杀虫，理气通络止痛，诸药合用，共奏活血散瘀、消肿止痛之功效。杨家龙等［20］研究显示复方牙痛酊对口腔常见致病菌标准株有杀菌作用，对牙龈卟啉单胞菌的抑制作用最强，临床研究亦证实复方牙痛酊有较好的消炎、镇痛效果。本研究结果显示，复方牙痛酊治疗牙周炎的综合疗效优于盐酸米诺环素，具有较好地治疗效果。

综上研究表明，复方牙痛酊通过抑制MMPs 和炎性因子释放，这可能是复方牙痛酊发挥作用的机制之一。