利拉鲁肽改善2型糖尿病大鼠牙周炎的机制

陈 晨,陈 栋,陆 珂,王 茜

1.商丘市中心医院口腔科,商丘 476000;2.郑州大学第一附属医院正畸科,郑州 450052

牙周病是发生在牙周组织的一种慢性破坏性进行性疾病,是导致成年人牙齿损伤及缺失的主要原因[1]。牙周炎患者血清中炎性因子水平升高,与胰岛素敏感性的降低密切相关[2]。糖尿病患者牙周病的发生率和严重程度均高于非糖尿病患者,当用利拉鲁肽(liraglutide,LIRA)处理原发性2型糖尿病大鼠时,大鼠骨小梁和皮层骨矿物质的密度增加,骨微结构缺陷改善[3]。也有研究表明,LIRA可以降低肿瘤坏死因子或高糖诱导的内皮细胞氧化应激和炎症反应[4]。因此,本研究主要分析LIRA对2型糖尿病大鼠牙周炎牙槽骨吸收及骨重建的作用,探讨其作用机制,为口腔医学的发展提供新思路。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ACCU-CHEK ACTIVE型罗氏血糖仪及配套试纸(德国罗氏公司);ST-360型全自动酶标仪(山东博科生物产业有限公司);Micro-CT[惠森生物科技(上海)有限公司];CX23型生物显微镜(日本Olympus公司);1658033型电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 试药

LIRA(国药准字J20160037,批号180316,丹麦诺和诺德制药有限公司);兔抗大鼠脂联素(adiponectin,ADPN),骨钙素(osteocalcin,OC),骨保护素(osteoprotegerin,OPG),核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL),核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factorκB,RANK)单抗及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(批号分别为ab133347、ab93876、ab255723、ab281216、ab239607、ab6721),均购自美国Abcam公司;空腹胰岛素(fasting insulin,FINS),肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA试剂盒(批号分别为190619、190327、190118),均购自上海市瑞番生物科技有限公司。

1.3 动物

SPF级健康SD雄性大鼠70只,体质量100～110 g,4周龄,由上海南方模式生物科技股份有限公司提供,生产许可号SCXK(沪)2019-0002。所有大鼠实验前于室温23～25 ℃、湿度60%～65%、人工12 h昼/夜循环照明、分笼饲养,自由摄食及饮水。

2 方法

2.1 建模及分组

随机取55只大鼠,用30 g·L-1的戊巴比妥钠30 mg·kg-1腹腔注射麻醉,仰卧固定,用丝线结扎上颌右侧第一磨牙2～3圈,在牙龈上缝一针固定丝线,剩余15只大鼠作为对照组,对照组不做手术处理。从实验当天起,建模大鼠用高糖高脂饲料喂养,对照组用常规饲料喂养。喂养1个月后,禁食不禁水12 h,建模大鼠按30 mg·kg-1腹腔注射质量浓度为1 mg·mL-1的链脲佐菌素溶液(用0.1 mmol·L-1柠檬酸缓冲液冰浴配制,现配现用);对照组腹腔注射等体积的0.1 mmol·L-1柠檬酸缓冲液。注射后禁食3 h,给予大鼠质量浓度为3 g·mL-1的葡萄糖溶液预防低血糖。3 d后,所有大鼠禁食12 h,尾静脉采血测空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),FBG≥16.7 mmol·L-1,且维持1周以上,视为造模成功。同时,肉眼检查大鼠牙龈组织有充血、出血、肿胀、溢脓、溃疡和糜烂等现象,并且牙龈指数≥2,即牙周炎建模成功。国际通用牙龈指数评价标准[5]:牙龈健康为0分;牙龈轻度炎症,即牙龈的颜色有轻度改变并有轻度水肿,探诊不出血为1分;牙龈有中等炎症,即牙龈色红,水肿光亮,探诊出血为2分;牙龈有严重炎症,即牙龈明显红肿或有溃疡,并有自动出血倾向为3分。将建模成功的47只大鼠随机分为模型组15只,LIRA组、LIRA+ADPN组,各16只。

2.2 干预方法

LIRA在无菌环境下用生理盐水稀释成质量浓度为300 μg·mL-1的溶液。LIRA+ADPN组腹腔注射300 μg·kg-1LIRA和10 μg·kg-1ADPN;LIRA组腹腔注射300 μg·kg-1LIRA和等量生理盐水;模型组和对照组注射等量生理盐水。LIRA和ADPN均每天注射1次,间隔4 h,共注射30 d。

2.3 各组大鼠FBG、FINS水平检测

所有大鼠禁食12 h,尾静脉取血,取血后用血糖仪测定各组大鼠药物干预0、15、30 d的FBG水平。末次干预后,大鼠禁食12 h,尾静脉取血,以3 000 r·min-1,离心10 min,取上层血清,用ELISA试剂盒检测FINS的水平,按照试剂盒说明书加样,测定450 nm处的吸光度(A),绘制标准曲线,计算FINS的水平。

2.4 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平检测

取血清,用ELISA测定TNF-α和IL-1β的水平。分别按照TNF-α和IL-1βELISA试剂盒说明书中的步骤加样,用全自动酶标仪测定450 nm处的吸光度(A),通过绘制标准曲线得TNF-α和IL-1β的质量浓度。

2.5 Micro-CT观察各组大鼠釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离

处死大鼠,分离上颌骨、上槽牙、牙组织和牙周组织,各组留5只大鼠牙周组织保存于-80 ℃,其余用体积分数为4%的多聚甲醛固定24 h,对标本进行修整,保留右侧磨牙区段颌骨及牙周组织,去除其余组织,进行三维CT拍摄,测量釉牙骨质界至牙槽嵴顶(cemento enamel junction to the aleolar crest,CEJ-AC)的距离,对牙槽骨吸收情况进行观察。

2.6 HE染色观察牙周组织病理变化及牙龈指数

用体积分数4%的多聚甲醛对上颌骨、上槽牙、牙组织及牙周组织固定24 h后,用质量浓度为10 g·mL-1的盐酸脱钙,用流水冲洗2 h,用梯度乙醇脱水(高体积分数到低体积分数),用石蜡包埋,切片(厚4～5 μm),用苏木精染色5 min,用流水冲洗1 s,用质量浓度为1 g·mL-1的盐酸乙醇分化1 s,水洗30 s,用促蓝液反蓝10 s,用流水冲洗10 min,用蒸馏水洗1 min,用曙红液染色3 min,用蒸馏水洗1 min,梯度乙醇脱水(低体积分数到高体积分数),用二甲苯透明5 min,用中性树胶封片,于光学显微镜下观察牙龈、牙周膜和牙槽骨等牙周组织病变。

2.7 Western blot检测蛋白相对表达水平

取保存于-80 ℃的大鼠牙周组织,置于液氮中研磨,加入蛋白提取裂解液,裂解后离心,取上清液,进行蛋白定量后,95 ℃水浴使蛋白变性,进行SDS-PAGE凝胶电泳,电转至PVDF膜,用质量浓度为50 g·L-1的脱脂牛奶室温封闭2 h,洗膜后分别加入1∶1 000稀释的OC、OPG、RANKL和RANK一抗,4 ℃孵育过夜,洗膜后加入经1∶4 000辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG,室温孵育1 h,洗膜后加入ECL发光液显影,采用Image J软件分析图像,以β-actin为内参,OC、OPG、RANKL和RANK蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值表示各蛋白的相对表达量。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠FBG及FINS水平

干预0 d,与对照组比较,模型组、LIRA组和LIRA+ADPN组大鼠FBG水平升高(P<0.05),且模型组、LIRA组和LIRA+ADPN组大鼠FBG水平无明显差异(P>0.05);与对照组比较,模型组、LIRA组和LIRA+ADPN组大鼠干预15、30 d FBG以及FINS水平升高,且FBG、FINS水平模型组>LIRA+ADPN组>LIRA组(P<0.05);随着干预时间的延长,对照组、模型组FBG水平无明显变化(P>0.05),LIRA组、LIRA+ADPN组FBG水平逐渐降低(P<0.05)。结果见表1。

表1 各组大鼠FBG及FINS水平的比较

3.2 大鼠血清TNF-α、IL-1β水平

大鼠血清TNF-α、IL-1β水平组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,模型组、LIRA组和LIRA+ADPN组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05);与模型组比较,LIRA组、LIRA+ADPN组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平降低,且LIRA组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平低于LIRA+ADPN组(P<0.05)。结果见表2。

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的比较

3.3 大鼠CEJ-AC值

大鼠CEJ-AC值组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,模型组、LIRA组和LIRA+ADPN组大鼠CEJ-AC值升高(P<0.05);与模型组比较,LIRA组、LIRA+ADPN组大鼠CEJ-AC值降低,且LIRA组大鼠的CEJ-AC值低于LIRA+ADPN组(P<0.05)。结果见表3。

表3 各组大鼠CEJ-AC值的比较

3.4 大鼠牙周组织的病理变化及牙龈指数

对照组大鼠牙周组织正常;模型组大鼠牙龈组织糜烂、溃疡,炎性细胞形成,牙周袋出现并加深,牙槽骨骨吸收陷窝形成;LIRA组和LIRA+ADPN组大鼠牙龈组织破坏情况得到改善,炎性细胞减少,牙周袋逐渐变浅,牙周间隙逐渐恢复正常,出现新生牙槽骨,且LIRA组修复效果更好。牙龈指数分别为:模型组(2.19±0.27)分、LIRA组(0.68±0.07)分、LIRA+ADPN组(1.15±0.13)分,牙龈指数组间比较,差异有统计学意义(F=37.247,P<0.05)。与模型组比较,LIRA组和LIRA+ADPN组牙龈指数降低(t=12.105,7.760,P<0.05);与LIRA组比较,LIRA+ADPN组牙龈指数升高(t=7.118,P<0.05)。结果见图1。

图1 各组大鼠牙周组织的病理变化(HE×200)

3.5 大鼠牙周组织蛋白的相对表达水平

大鼠牙周组织OC、OPG、RANKL、RANK蛋白的相对表达水平组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,模型组、LIRA组和LIRA+ADPN组OC和OPG蛋白的相对表达水平降低,RANKL、RANK蛋白的相对表达水平升高(P<0.05);与模型组比较,LIRA组、LIRA+ADPN组OC和OPG蛋白的相对表达水平升高,RANKL、RANK蛋白的相对表达水平降低(P<0.05);与LIRA组比较,LIRA+ADPN组OC和OPG蛋白的相对表达水平降低,RANKL、RANK蛋白的相对表达水平升高(P<0.05)。结果见表4、图2。

图2 大鼠牙周组织蛋白的表达水平

表4 大鼠牙周组织蛋白相对表达水平的比较

4 讨论

糖尿病易造成患者机体免疫力下降、牙槽骨吸收,影响患者牙周炎的恢复[6-7]。牙周炎与糖尿病相互影响,前者可影响糖尿病患者的代谢, 后者使发生炎症的风险提高,治疗时需要兼顾二者。

LIRA能调节患者糖脂代谢、改善胰岛功能,还具有抗炎作用和骨保护作用[8]。因此,探究LIRA对2型糖尿病大鼠牙周炎牙槽骨吸收及骨重建的作用,对于临床治疗牙周炎具有理论指导作用。

糖尿病使机体处于高炎症状态,IL-1β和TNF-α的水平显著升高,从而损害牙周组织[9-10]。陆威等[11]研究发现,可通过抑制IL-1β、TNF-α的表达水平,减轻糖尿病大鼠牙龈组织炎症反应。吴晓静等[12]研究发现,LIRA通过抑制NF-κB、TNF-α和IL-6的表达,改善胰岛素抵抗大鼠的肾功能。张瑶等[13]研究表明,LIRA通过调节氧化应激反应及IL-1β、IL-6和TNF-α的水平,改善高同型半胱氨酸血症诱导的大鼠海马组织损伤。以上研究均表明LIRA具有明显抗炎作用。本研究中,与模型组比较,LIRA组干预15、30 d FBG、FINS、TNF-α和IL-1β水平降低,LIRA组牙龈组织破坏情况得到改善,牙龈指数降低,CEJ-AC值降低,表明LIRA可使炎症反应减轻,改善牙周组织损伤,降低FBG、FINS水平,缓解2型糖尿病。

血清中OC的水平与骨中OC的水平呈正相关,可用作骨形成的生物学指标[14]。OPG和RANKL参与破骨细胞的分化和活化,在牙周炎牙槽骨吸收过程中起重要作用[15-16]。RANK是RANKL的功能受体,主要在破骨细胞前体和成熟破骨细胞表面表达。在骨吸收过程中,RANKL、RANK和OPG三者共同参与调节破骨细胞的分化[17-18]。研究显示,RANKL及其受体RANK可调节前体骨细胞的分化,刺激破骨细胞的形成,导致牙槽骨的吸收[19]。而OPG则通过与RANKL高亲合性结合,抑制其促进破骨细胞分化的作用。陈洪燕等[20]研究表明,通过调控OPG/RANKL/RANK通路关键蛋白的表达,可显著提高骨质疏松大鼠的骨密度。本研究中,LIRA组OC、OPG蛋白的相对表达水平升高,RANKL、RANK蛋白的相对表达水平降低,且LIRA+ADPN组OC、OPG蛋白的相对表达水平低于LIRA组,RANKL、RANK蛋白的相对表达水平高于LIRA组,表明LIRA通过上调OPG、下调RANKL和RANK抑制2型糖尿病大鼠牙周炎牙槽骨吸收,促进骨重建。

综上所述,LIRA通过激活OPG/RANKL/RANK通路改善2型糖尿病大鼠牙周炎牙槽骨的吸收,促进骨重建。