一个野生毛头鬼伞菌株的鉴定与评价*

曹雪莲，辜运富，陈 影，刘天海，周 洁，王 迪，彭卫红，唐 杰

（1.四川农业大学，四川 成都 611130；2.四川省食用菌研究所，四川 成都 610066）

毛头鬼伞[Coprinus comatus（O.F.Müll.）Pers]，又名鸡腿菇，隶属于真菌界（Fungi）担子菌门（Basidiomycota）蘑菇纲（Agaricomycetes）蘑菇目（Agaricales）蘑菇科（Agaricaceae）鬼伞属（Coprinus）[1]，野生种质资源分布于我国四川、云南、河北、山东、黑龙江、山西、新疆、吉林和内蒙古等省、市（自治区）[2]。毛头鬼伞是一种食药兼用的真菌，营养丰富，具有清神宁智、增进食欲、降血脂、降血糖等保健功效[3-5]，被誉为“菌中新秀”[6]。我国毛头鬼伞的人工栽培始于80年代初期，其生物转化率较高、生长周期短且易于栽培，近年来在我国大宗栽培的食用菌中已经占有突出地位。目前对于毛头鬼伞的研究主要集中在资源分类、栽培技术和生理活性等方面。现有的栽培品种（菌株）较少，尚不能满足市场对优良品种的需求，野生种质的采集和驯化可为优良菌株的选育提供物质基础。因此，在成都市锦江区沙河公园采集到野生子实体后，立即对野生子实体进行组织分离纯化，以形态学结合ITS序列进行分析，鉴定其为毛头鬼伞。并进行制种和栽培试验，通过对子实体农艺性状观测、营养成分分析和氨基酸营养价值评价，筛选出营养成分丰富、营养价值高的毛头鬼伞菌株，为野生毛头鬼伞优良种质资源的进一步利用提供有力的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

2019年5月19日在成都市锦江区沙河公园采集到野生子实体，见图1；川毛头鬼伞1号，由四川省食用菌研究所提供。

图1 野生子实体Fig.1 Fruit body collected from the wild

1.1.2 主要试剂与仪器

Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒，杭州博日科技有限公司产品；通用引物ITS4/ITS5（5′-TCTCCGCTTATTGATATGC-3′/5′-GGAAGTAAAAGTC GTAACAAGG-3′），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；1.1×T3 Super PCR Mix，北京擎科生物科技有限公司提供；Biometra PCR仪，美国伯乐仪器公司；Thermo超微量分光光度计，美国赛默飞世尔科技公司。

1.1.3 供试培养基

PDA培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、硫酸镁0.05%、磷酸二氢钾0.05%、磷酸氢二钾0.1%、琼脂2%。用于子实体组织分离、菌丝体纯化和提取DNA的样品培养。

母种培养基：蛋白胨0.2%、酵母浸粉0.2%、葡萄糖2%、硫酸镁0.05%、磷酸二氢钾0.05%、磷酸氢二钾0.1%、琼脂2%。

原种培养料：棉籽壳80%、麸皮10%、玉米粉7%、石膏1%、石灰2%，含水量60%～62%。

栽培种培养料：菌糠40%、麦麸30%、稻草20%、麦秸8%、石灰1%、石膏1%，含水量60%～62%。

1.2 分离纯化

对野生子实体进行组织分离、纯化培养，获得菌株编号为C42。

1.3 鉴定

1.3.1 形态学鉴定和细胞学观察

参照《中国食用菌百科》[7]和《中国大型真菌原色图鉴》[8]对野生子实体进行比对；光学显微镜对子实体孢子和菌丝体进行观察、形态学鉴定并描述[9-10]。

1.3.2 ITS分析鉴定

菌丝DNA提取：收集菌丝体，放入-20℃冰箱过夜，液氮研磨，利用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA基因组的提取，超微量分光光度计检测DNA浓度，DNA溶液置入-20℃冰箱备用。

ITS-PCR 反应体系（25 μL）：ITS4/ITS5引物各1 μL，DNA 模板 1 μL，PCR Mix 22 μL。反应条件：98℃预变性 2 min；98℃变性 10 s，55℃退火 10 s，72℃延伸10 s，共35个循环；72℃延伸2 min；4℃终止反应。PCR产物双向测序由北京擎科生物科技有限公司完成。

测序结果在GenBank进行序列Blast比对。采用Clustal X软件进行多序列比对，MEGA 6.1软件计算遗传距离、Neighbor-Joining法构建系统发育进化树，进行系统发育分析。

1.4 栽培方法

1.4.1 母种、原种和栽培种的制备

母种制备：将分离得到的纯培养物接种到PDA试管上（20 mm×200 mm），在25℃避光恒温培养，待菌丝体长满斜面，备用。

原种制备：将制备好的母种接种到原种瓶中，25℃避光培养至满瓶，备用。

栽培种制备：栽培袋为聚乙烯袋（规格200 mm×480 mm×0.028 mm），每袋干料重0.9 kg～1.0 kg，湿料重2.4 kg～2.5 kg，袋子两端接种，共制备50袋，20℃～25℃避光培养至菌丝体满袋。

1.4.2 出菇管理

栽培种满袋后进行覆土栽培。畦面宽1 m，畦高15 cm～20 cm，畦面均匀撒一层石灰，将栽培种菌袋放在畦面，菌袋两端划口，覆土3 cm～5 cm，加盖黑色遮阳网小拱棚。每天定时将小拱棚打开通风换气，每天定时喷洒水保持畦面湿润。畦面出现原基后再次覆土，待子实体长满畦面，对第一潮菇进行观测和采收。采收标准为子实体菌盖紧实，菌盖与菌柄贴合。

1.5 农艺性状测定

子实体农艺性状分为观测性状和测量性状。观测性状包括菌盖形状、菌盖颜色、菌盖鳞片有无、菌柄颜色和菌柄基部是否膨大；测量性状为菌盖长度、菌盖直径、菌柄长度、菌柄直径和菌柄基部直径，具体测量位置见图2。

图2 子实体纵切面Fig.2 Vertical section of an Coprinus comatus fruit body

1.6 营养成分测定和氨基酸营养价值评价

1.6.1 营养成分测定

委托四川省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所测定毛头鬼伞新鲜子实体样品，主要测定的营养成分有水分、灰分、粗纤维、粗多糖、粗蛋白和氨基酸[11-16]。

1.6.2 氨基酸营养价值评价

利用FAO/WHO的必需氨基酸模式[17]，计算、比较分析蛋白质的营养价值[18]。必需氨基酸比值（RAA）的计算公式为：

式中：Ax为必需氨基酸的含量（%）；As为（FAO/WHO）模式中相应的氨基酸含量（%）。

必需氨基酸比值系数（RC）的计算公式为：

式中：RAA为必需氨基酸比值；AR为必需氨基酸RAA比值均数。

必需氨基酸比值系数分（SRC）的计算公式为：

式中：RSD为RC的相对标准差。

1.7 数据分析

采用Excel进行数据处理，用SPSS进行数据差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 鉴定结果

2.1.1 显微形态观察

菌株C42的担孢子、菌丝体及菌落形态特征见图3。

图3 形态特征Fig.3 Morphological characteristics

如图3所示，菌株C42的担孢子呈椭圆形，大小为9.84 μm×6.96 μm，表面光滑，颜色呈黑色。显微镜下菌株C42的菌丝半透明，有锁状联合。菌株C42在25℃平板培养10 d～14 d，菌落的气生菌丝密度密，菌落边缘整齐。

2.1.2 ITS序列

菌株C42的ITS序列共658个碱基，GenBank登录号为MW850417，以珠鸡斑白鬼伞（Leucocoprinus meieagris）MH861816.1为外群，建立系统发育树，见图4。

图4 系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree

如图4所示，菌株C42与Coprinus comatus（Gen－Bank登录号：MK169229）的相似性高达100%，并结合形态学鉴定结果，鉴定其为毛头鬼伞（Coprinus comatus）。

2.2 农艺性状

菌株C42和菌株C20的子实体形态见图5，观测性状和测量性状统计结果见表1。

图5 菌株C20（A）和菌株C42（B）的子实体Fig.5 fruit bodies of strain C20（A）and strain C42（B）

由图5和表1可知，菌株C42与菌株C20子实体形态相似，2个菌株的菌盖形状、菌盖颜色、菌盖鳞片、菌柄颜色和菌柄基部形态无差异。测量性状中，菌株C42的菌盖长度、菌柄长度和菌盖直径均比菌株C20的测量值大，但菌柄直径和菌柄基部直径均比菌株C20的测量值小。

表1 子实体的农艺性状Tab.1 Agronomic characters of fruit bodies

2.3 营养成分和氨基酸营养价值分析

2.3.1 营养成分分析

菌株C42和菌株C20的营养成分分析结果见表2。

由表2可知，菌株C42的水分含量低于菌株C20，差异不显著；菌株C42的灰分和粗纤维含量高于菌株C20，差异不显著；菌株C42的粗多糖和粗蛋白含量高于菌株C20，差异显著。

表2 2个毛头鬼伞菌株的营养成分Tab.2 Nutrient composition of two strains of Coprinus comatus

2.3.2 氨基酸含量分析

对2株毛头鬼伞的氨基酸进行检测及计算，结果见表3。

由表3可知，C42的总氨基酸含量（TAA）、总必需氨基酸含量（TIAA）和总药用氨基酸含量（TMAA）都高于C20。

表3 2株毛头鬼伞氨基酸Tab.3 Amino acids of two strains of Coprinus comatus

2.3.3 氨基酸营养价值评价

2个毛头鬼伞菌株的必需氨基酸含量与FAO/WHO模式谱的必需氨基酸进行比较，结果见表4。

由表4可知，菌株C42的蛋氨酸+半胱氨酸和赖氨酸的质量分数高于菌株C20，但其他必需氨基酸的质量分数均低于菌株C20。2个菌株的7种必需氨基酸质量分数均高于FAO/WHO模式谱，由此说明菌株C42和菌株C20的营养均衡合理，具有一定的营养价值。

表4 2个毛头鬼伞菌株与FAO/WHO模式谱必需氨基酸的比较Tab.4 Comparison of indispensable amino acids between two strains of Coprinus comatu and FAO/WHO pattern spectra

计算2个毛头鬼伞菌株的RAA、RC及SRC值，结果见表5。

由表5可知，菌株C42和菌株C20中蛋氨酸+半胱氨酸、亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的RC＜1，表明这些氨基酸在蛋白质中相对不足；苏氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸和赖氨酸的RC＞1，表明这些氨基酸在蛋白质中相对过剩[19]。菌株C42的SRC大于菌株C20，说明菌株C42的蛋白质营养价值高于菌株C20。

表5 2株毛头鬼伞的RAA、RC及SRC值Tab.5 RAA,RC and SRC of two trains of Coprinus comatu

3 讨论

由于毛头鬼伞的营养价值和药用价值较高，早在20世纪90年代就开始在全国各地大面积栽培；2020年末其产量占全国食用菌产量的0.31%，且呈现继续增长趋势；因此亟需选育优良菌株。

通过对野生子实体进行分离纯化，将获得的毛头鬼伞菌株C42进行覆土栽培，驯化出菇。试验发现，野生子实体驯化后的菌株C42菌盖鳞片不明显，菌柄基部膨大，与对照菌株C20的农艺性状相比观测性状无明显差异；测量性状中菌株C42的菌盖长度、菌柄长度和菌盖直径比菌株C20的测量值高，菌柄直径和菌柄基部直径比菌株C20的测量值低，综合农艺性状较好。子实体鲜样的营养成分测定结果表明，菌株C42的营养成分比菌株C20高，粗多糖和粗蛋白的含量有显著差异；2个菌株的必需氨基酸质量分数均高于FAO/WHO模式谱，且第一限制氨基酸均为蛋氨酸和半胱氨酸，与曹晋良[20]研究的结果一致；比较2个菌株的SRC值，发现菌株C42的蛋白质营养价值高于菌株C20。该野生毛头鬼伞菌株营养成分丰富，营养价值高，具有进一步发掘利用的价值。