双色谱柱/双检测器顶空气相色谱法检验全血乙醇的性能评估

林传俊，刘永粉，杨 浩 ，汪宏良，2b*

(1.鄂东医疗集团黄石市中心医院(湖北理工学院附属医院) 医学检验科,湖北 黄石 435000；2.湖北理工学院 a.医学院，b.肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室,湖北 黄石 435003)

过量饮酒会造成心、脑、肝、肾及周围神经系统等的损伤，人体血液乙醇含量的检验对于医疗救治评估、“酒驾”和“醉驾”交通检查等具有十分重要的意义。

临床实验室主要采用酶学法、化学方法和干化学法等进行血液乙醇的检验分析，然而，这些方法在灵敏度和特异性方面存在一定不足。目前，顶空气相色谱法是被广泛认可的用于检测乙醇含量的检验方法，因此，临床实验室有必要引进并建立顶空气相色谱法检验全血乙醇浓度以服务临床和患者。

双色谱柱/双检测器顶空气相色谱法检验全血乙醇是将待测样品放在密闭系统中加热到一定温度，使乙醇在气相和液相中达到平衡，待样品进入色谱柱，其乙醇在2根色谱柱上的色谱具有不同的保留行为，用2个氢火焰化离子检测器对分离出的组分进行检测，同时与乙醇标准品进行比较，以保留时间定性，用乙醇峰面积和内标物峰面积的比值进行定量。该技术可以有效减少仪器系统性误差，使定性更加准确、操作更简便、干扰更小，且在定量方面具有灵敏度高、准确率高等优点[1-2]。

实验室在选择检测系统和检验方法时应对系统的性能进行全面评价，以保证结果的可靠性。依据美国临床实验室标准化委员会的相关性能评价文件[3-6]和相关行业标准[7-8]，对实验室赛默飞Trace GC 1300气相色谱仪和 TriPlus 500顶空自动进样器检测系统的定性和定量分析性能进行评估，以确定检测系统的性能指标符合行业要求。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

主要仪器：Trace GC 1300气相色谱仪(ThermoFisher)；TriPlus 500顶空自动进样器(ThermoFisher)。

主要试剂：乙醇、叔丁醇，色谱纯，购于阿拉丁试剂有限公司。

1.2 配制溶液

乙醇标准储备液：称取50 mg乙醇，加二级水定容至5 mL，备用。

乙醇标准工作溶液：将乙醇标准储备液逐渐稀释，配成浓度分别为1，10，20，80，100，200 mg/100 mL的标准溶液。

叔丁醇内标工作溶液：准确称取80 mg叔丁醇，加二级水定容至100 mL，使其浓度达到80 mg/100 mL[9]。

1.3 建立标准曲线

取1，10，20，80，100，200 mg/100 mL的乙醇标准工作溶液各0.10 mL，加入样品瓶内，再取0.5 mL 80 mg/100 mL的叔丁醇内标工作溶液加入样品瓶，密封、混匀后，置于顶空自动进样器中进样测定，建立校准曲线的回归方程。

1.4 实验方法

1.4.1顶空气相色谱条件

色谱柱： Thermo ScientificTMTraceGOLDTMTG-ALC 1 30 m×0.53 mm×3.0 μm (P/N 26063-3960) 和TraceGOLDTMTG-ALC 2 30 m×0.53 mm×1.0 μm(P/N 26063-2980)；柱温：40 ℃恒温；检测器类型和工作参数：FID检测器，温度为250 ℃；氮气∶氢气∶空气=40∶35∶350 (mL/min)；载气类型及流速：氮气，恒流模式，流速为1.0 mL/min；进样方式及体积：样品瓶加热平衡时间10 min，加压时间0.1 min，辅助气压10 kPa，柱流量为10 mL/min，吹扫流量为10 mL/min，分流量为100 mL/min，传输线温度110 ℃，定量环温度105 ℃，样品管路温度105 ℃，进样体积为1 mL。

1.4.2比对实验

收集浓度在分析测量范围内的样本20份，样本随机排列，分4批连续检测，将Trace GC 1300前检测器和后检测器所测乙醇结果作比较，前检测器为比较方法，后检测器为实验方法。

1.4.3精密度验证

取空白全血1.80 mL和1.20 mL，分别添加浓度为200 mg/100 mL的乙醇标准液0.20 mL和0.80 mL，密封保存[10-11]。将该样品作为精密度验证材料，每日分析1批，每批每个水平测定3次，连续5 d。

1.4.4回收试验

取空白全血1.95，1.80和1.20 mL，分别添加浓度为200 mg/100 mL的乙醇标准液0.05，0.20和0.80 mL，密封保存。将该样品作为回收试验材料，在1个分析批内检测完毕。

1.4.5统计学处理

2 结果与讨论

2.1 定性结果

图1 前检测器乙醇及内标叔丁醇的色谱图(10 mg/100 mL乙醇标准品)

图2 后检测器乙醇及内标叔丁醇的色谱图(10 mg/100 mL乙醇标准品)

表1 前检测器和后检测器乙醇、叔丁醇组分的保留时间 min

2.2 方法的线性关系、检出限和定量性

前检测器和后检测器乙醇标准工作液线性关系分别如图3和图4所示。乙醇标准工作液经顶空进样器进样后，乙醇与叔丁醇峰形良好，以乙醇峰面积与叔丁醇峰面积的比值为纵坐标，乙醇浓度为横坐标做标准曲线，在1～200 mg/100 mL范围内呈良好的线性关系。前检测器回归方程为Y=0.0057X-0.0058,决定系数R2=0.9995；后检测器回归方程为Y=0.0057X-0.0067,决定系数R2=0.9994。以3倍信噪比表示方法的检出限，前检测器检出限为0.11 mg/100 mL，后检测器检出限为0.10 mg/100 mL。以10倍信噪比表示方法的定量限，前检测器定量限为0.38 mg/100 mL，后检测器定量限为0.34 mg/100 mL。

图3 前检测器乙醇标准工作液线性关系

图4 后检测器乙醇标准工作液线性关系

2.3 比对结果

前检测器与后检测器结果散点图如图5所示。前检测器与后检测器结果比较的相对偏倚图如图6所示。

图5 前检测器与后检测器结果散点图

图6 前检测器与后检测器结果比较的相对偏倚图

将Trace GC1300前检测器和后检测器所测20份样本的乙醇结果作比较，Deming线性回归方程为Y=1.0066X-0.3473，系数R2=0.9992，相对偏倚均控制在5.0%以内[8]。以乙醇浓度5，20和80 mg/100 mL作为监测阈值，则其偏倚分别为6.29%，1.08%和0.23%。2组数据采用t检验，P>0.05(P=0.47)，差异无统计学意义。

2.4 精密度结果

前检测器和后检测器的精密度见表2。由表2可知，前检测器批内变异系数和室内变异系数分别为1.76%，0.90%，2.39%，1.38%；后检测器批内变异系数和室内变异系数分别为2.12%，0.91%，2.20%，1.58%。

表2 前检测器和后检测器的精密度

2.5 方法回收率

前检测器和后检测器的回收率见表3。乙醇理论浓度为5，20和80 mg/100 mL，在该范围内，前检测器和后检测器的平均回收率为99.47%～108.10%。

表3 前检测器和后检测器的回收率

3 结论

双色谱柱/双检测器顶空气相色谱法检验全血乙醇结果明显好于单检测器顶空气相色谱法，前检测器和后检测的回收率表明检测系统能满足临床检验全血乙醇的需要，但需进一步控制后检测器系统误差，确保检验结果的一致性。